大鼠网膜素(omentin)ELISA试剂盒
标本的采集及保存 :
1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000 g离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本:1000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测▅。
标本的稀释原则:
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适▽当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内,检测的结果才是准确的。稀释的过程中,应做好详细的记⌒ 录。最后计算ω 浓度时,稀释了“N”倍,标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则:2瓶,每瓶临用』前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为200 mU/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释200 mU/ml,100 mU/ml,50 mU/ml,25 mU/ml,12.5 mU/ml,6.25 mU/ml,3.12 mU/ml,样品稀︾释液直接作为标准浓度0 mU/ml,临用前15分钟内配制。
如配制100 mU/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml)200 mU/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
生物素标记抗体的稀释原则:
临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总№量配制(每孔100μl),实际配制时应多配▆制0.1-0.2ml。如10μl生ㄨ物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的【比例配制,轻轻混匀,在使用前一△小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一◆小时内配制。
操作步骤:
实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混↑匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的卐检测范围。
1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品▃100μl,注意不◥要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃⊙动混匀,酶标板加上盖或々覆膜,37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作①液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,200μl/每孔,甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和】素工作液(同生物素◥标记抗体工作液) 100μl,37℃,60分钟。
5. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,200μl/每孔,甩干。
6. 依序每孔加○底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的↘前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔显色不明显,即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝〗色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反¤应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶⌒ 联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟↑以内进行检测。
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