北京方程生物公司代做科研实验技术服务Western Blot
Western Blot主要实验步骤如下：
1. 蛋白质抽提
a.实验对象为组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋◥白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋√白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2. 蛋白质定量
按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操№作说明操作，测定样品浓度。
3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)
将准备好的↓样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上〗样，标准加进第一个孔中㊣，电泳分离蛋白。
4. 蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜
按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流』条件下，4°C转移过夜。
5. 膜的封闭和抗体孵育
a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体⊙结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。。
6. 结果检测
化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光≡显影。图片◤扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
7. 数据分析
目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样▲品的目的蛋白相对含量。
8. 提供实验报告
包括详细的实验方法及免疫印迹实验结▂果的相关图表。
客户方需提ㄨ供：
1、抗体( 如Cell signaling technology, Santan Cruz,Abcam等著名抗体公≡司。)
2、实验样本
