碧波一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（通用型，适用于细胞、组织样本）

一、产品简介
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简
便的◤细胞凋亡检测方法。对于经∴过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显※微镜或流式细胞仪检测到凋亡细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进¤行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶♂(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微∏镜或流式细胞仪进行检测；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被『标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和Ψ 超薄切片）和细胞样ぷ本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
本试剂盒有如下优点：
1、高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的▓细胞凋亡。
2、特异性：TUNEL检测时通常】更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。
3、快速：仅需约1-2个小时↓即可完成。
4、操作简单：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用▼二抗等进行多步操作。
5、应用范围广：可以用于」检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋≡亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的◤凋亡情况。
二、试剂盒组份
组 份 Cat: BA2420 Cat: BA2450 Cat: BA24100 储存条件
平衡液 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃
荧光标记▓液 20μL 50μL 100μL -20℃避光
TdT酶 80μL 200μL 400μL -20℃
50×蛋白酶 K 40μL 100μL 200μL -20℃




三、试剂盒以外自备仪器和试剂
二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、盖玻片、载玻片、染色缸、荧光显微镜
四、保存条件：
-20℃保存，荧光标㊣记液需避光保存。
五、注意事项：
1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生█的DNA断裂，但不会检测出射线【等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断№为凋亡细胞。
2、极少数细胞凋亡时没□有DNA断裂，此时不◇适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发№现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。
3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
4、因本试剂盒中组分均为╳微量，使用前请□　离心。
5、为避免试验误差、降低〖试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
6、 TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中∩配制，再分别◣滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
7、为了您的安全♂和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
六、操作规程
A、检测样本的预处理
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样
本材料及首次试验结果来调▅整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
1、 对于细胞样本
a、 把准备◣好的细胞涂片或爬片自然晾干。
b、 把晾干的样本浸入固定液，室温（15-25℃）固定15-60min。
（固定液的配√制：4%多聚▃甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜♀配制↘）
c、 把固定好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
d、 把c步处理好⌒的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配¤制： 3%H2O2溶于无水甲醇）
e、 把d步】处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
f、 把e步处理好的样本浸≡入通透液中，冰上（2-8℃）促渗2min。
（通透液的配▓制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
g、 然后转入B步骤标记反应。
注意事项：
a、 为防止◣样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚△赖氨酸铺片。
b、 固定好的样▼本可以在-20℃的70%乙※醇中放置30分钟～一晚，以改善细胞的渗透性。
c、 使用PBS漂洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的↘脱落。
d、 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。
2、 对于石●蜡切片
a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
（如：二甲苯脱蜡∑　2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切●片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步处理好→的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
c、 把b步处理好的样本加入蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。
（蛋白酶K工作液的配「制：2μL 50×蛋白酶 K＋98μL PBS）
d、 把c步处理□好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）
f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
g、 然后转入B步骤标记反应。
注意事项：
a、 蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要ξ　自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条■件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400μg/mL）处理5分钟。（本试剂盒♀的50×Proteinase K浓度为1mg/mL）。
b、 其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法1:
将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配制√：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
替代方法2：
将脱蜡及水合好的切片↘浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶☆溶液的配制：0.25%-0.5%溶于HCl PH2；胰蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）
替代方法3:
将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓●冲液PH= 6 的塑》料盒中，置于█微波炉中350W（低档）处理5 min。为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
c、 使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
3、 对于冷冻切片
a、 把冰冻切片浸入固定液，室温（15-25℃）固定30min。
（固定液的配制：4%多聚〓甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制）
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次15min。
c、 把b步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）
d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
e、 把d步处理好的样本浸入通透液╱中，冰上（2-8℃）促渗2min
（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
f、 然后转入B步骤标记反应。
4、对于难处理的切片
a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
c、 把b步处理∑　好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中750W（高档）处理1 min
d、 迅速加入80ml双蒸水（20-25℃）加入c步处理好切片的塑料盒中，冷却至室温，将组织切片『转移至PBS（20-25℃）中。
e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）
f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次10min。
g、 然后转入B步骤标记反应。
5、阳性对照及阴性对照的准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需♀要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步ξ　聚与待测样本同样进行。
a、阳性对照样本的准备
组织样本在蛋白∮酶K处理、PBS浸洗后，细胞样本在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（用户自备）室温—37℃处理10 -30 min，其余〓步骤均相同。
（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）
b、阴性对照样本的准『备
在标记反应的过◣程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。
B、 标记反应：
1、 预处理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
2、 配制TdT酶反应液：
参考下表配制适当▲量的TdT酶反应液（根据需要按照↘比例放大），需充分混◣匀。注意：配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
平衡液 45μl 225μl 450μl
荧光标记液 1μl 5μl 10μl
TdT酶 4μl 20μl 40μl
TdT酶反应液╳总体积 50μl 250μl 500μl

3、 每个样本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加TdT酶）
4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
5、 荧光显微》镜下观察，可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。
操作注意事项：
1、 PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除※去PBS溶液←后再进行下一步反应。
2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻→片或保鲜膜，或在湿盒▅中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以∏防止反应液干燥造成实验失败。
3、 TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜卐长期保存，长期╱保存会导酶活性的失活。

七、常见问题的原因及推荐解决方案
现象 可能原因 建议

非特异性染▽色 TdT酶的浓度过高 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释
TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保♂持湿润。 注意控制反应时间，并确保TdT酶反应液能很〗好地覆盖样品。
光照→紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂） 尝试改用其它包埋材料或其∑它聚合试剂
在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用） 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定
使用了不适当的』固定液，例如一些△酸性固定液 采用推荐的固定液
固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂 用含有dUTP和 dAPT的溶液Ψ 封闭

标记率低 如果◎以乙醇或甲醇固定的样本则标记效〓率较低（因为在固定时染色质未能◤与蛋白质交联，而在操作中丢失） 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲︽醛固定
或福尔马林●或戊二醛固定。
固定时间过长，导致交联程度过高 减少固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲↓醛固定
荧光淬灭 Fluorescence在普∏通光照10分々钟就会严重淬灭，需注意避光操作

促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低 1、 增加通透剂促々渗时间
2、增加通透剂的作用温度▲（15-25℃）
3、优化蛋白酶K的作用浓①度和作用时间（如：以400ug/ml作用5min）
4、0.1M的◣柠檬酸钠70℃作用30min。
荧光背景很☆高 支原█体污染 请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染
TdT酶的浓度过高或反应时间过长☉ 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释或注意控制反应时╲间
红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重◥干扰。 宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
高速分裂和增殖的细胞，有ㄨ时也会出现细胞核中的DNA断裂。
阳性对照没〓有信号 DNase I的浓度过低 1、 冷冻≡切片使用∴3u/ml的DNase I
2、 石蜡切片使用 1500u/ml的DNase I
3、 一般样本使用10u/ml DNase I
组织样本↘从载玻片脱落 组织样本被酶从玻片消化下来 降低蛋白酶K的处理〖时间