碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)（石蜡切片专用）

一、产品简介
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。
细胞在发↘生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电∞泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能』够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
本试剂盒适用于石蜡包埋组织样本的凋亡原位检测。
本试剂盒有如下优点：
1、 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。
2、 操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有蛋█白酶 K 和DAB。
3、 特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。
4、 快速：仅需约3个小时即可完成。
5、 方便观察：使用光学显微镜观察实验结果，无需贵重设备。
二、试剂盒组份
组 份 Cat: BA2120 Cat: BA2150 Cat: BA21100 储存条件
平衡液 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃
TdT酶 80μL 200μL 400μL -20℃
50×蛋白酶 K 40μL 100μL 200μL -20℃
Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避光
Biotin-dUTP 20μL 50μL 100μL -20℃
DAB 2mg 5mg 10 mg -20℃避光


三、试剂盒以外自备仪器和试剂
二甲苯、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等；
盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、光学显微镜、37℃孵箱、移液器等。
四、保存条件：
-20℃保存，Streptavidin-HRP和DAB需避光≡保存。
五、注意事项：
1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋←亡细胞判断为凋亡细胞。
2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。
3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
4、因本试№剂盒中组分均为微量，使用前请离心。
5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
6、 TdT 酶反应液〓最好在使用前根椐样本数量集中配╳制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
7、DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使ζ　用。
8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
六、操作规程
A、检测样本的预处理
TUNEL检测时样本的预处理♀是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样
本材料及首次试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度∴等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
1、 对于常规石蜡切片
a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
（如：二＠ 甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的▓切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
c、 把b步处■理好的样本加入蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。
（蛋白酶K工作→液的配制：2μL 50×蛋白酶 K＋98μL PBS）
d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制∏： 3%H2O2溶于甲醇）
f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
g、 然后转入B步骤标记和显色反应。
注意事项：
a、 蛋白酶K处理的使※用浓度、处理时间及温度，都因㊣组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的蛋△白酶K（400μg/mL）处理5分钟。（本试剂盒的50×蛋白酶K浓度为1mg/mL）。
b、 其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法1:
将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通①透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜⊙配制）
替代方法2：
将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于HCl PH2；胰蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）
替代方法3:
将脱蜡及水合好的切片ω　浸入含200ml 0.1M的柠檬︾酸缓冲液PH= 6 的塑＠料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5 min。为防止样本脱落，请使用〒硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
c、 使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
2、 对于难处理○的石蜡切片
a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
c、 把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中750W（高档）处理1 min。
d、 迅速加入80ml双蒸水（20-25℃）加入c步处理好切片的塑料盒中，冷却至室温，将组织切片转移至PBS（20-25℃）中。
e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）
f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次10min。
g、 然后转入B步骤标记和显色反应。
3、阳性¤对照及阴性对照的准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。
a、阳性对照样本的准备▆
组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（用户自备）室温—37℃处理10 -30 min，其余步〇骤均相同。
（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）
b、阴性对照样本▲的准备
在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。
B、 标记和显色反应：
1、 预处理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或卐吸水纸吸干。
2、 配制TdT酶反应液：
参考下表配制适当量的TdT酶反应液（根据需要按照比例放大），需充【分混匀↓。注意：配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
平衡液 45μl 225μl 450μl
Biotin-dUTP 1μl 5μl 10μl
TdT酶 4μl 20μl 40μl
TdT酶反应液总体积 50μl 250μl 500μl

3、 每个样№本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加ξTdT酶）
4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
5、 Streptavidin-HRP及DAB工作液的配制：
Streptavidin-HRP工作液的配制：
参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
Streptavidin-HRP 0.5μl 2.5μl 5μl
PBS 99.5μl 497.5μl 995μl
Streptavidin-HRP工作液总体积 100μl 500μl 1000μl

DAB工作液的配制：
a、先把试剂盒中DAB粉末用PBS溶解配制成20×DAB（10 mg/ml），配制方法如下：
DAB 2mg 5mg 10mg
PBS 0.2ml 0.5ml 1.0ml
配制成20×DAB（10 mg/ml），放于-20℃保存

b、DAB工作液的配制：
参考下表配制适量的DAB工作液，需充分混匀。注意：配制好的DAB工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
20×DAB（10 mg/ml） 5μl 25μl 50μl
30％H2O2 1μl 5μl 10μl
PBS 94μl 470μl 940
DAB工作液总体积 100μl 500μl 1000μl


6、 将第5步处理好的样本周围用滤纸或吸ㄨ水纸吸干，再滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30min。
7、 把第6步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
8、 将第7步处理好的样本滴加50μL-100μL DAB工作液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。注意：如果显色很强可以短♀于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。
9、 把第8步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光学显◥微镜下观察、拍照。
10、选做(本步骤可不做)：用苏木〓素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色后用光学显微镜下观察、拍照。
具体的步骤请参照操作⊙注意事项中的苏木素复】染
操作注意事项：
1、 PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。
2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖▅上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
3、 TdT酶反应液即用即配，短暂ㄨ于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
4、 如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使∞用，需重新配制。
5、 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色----- 30min ，蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即◥用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡-----5min。用二甲苯浸泡-----10min，更换二甲苯后再浸泡-----10min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。

七、常见问题的原因及推荐解决方案.
现象 可能原因 建议

非特异性染⊙色 TdT酶的浓度过高 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释
TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。 注意控制反应时间，并确保TdT酶反应液能很〗好地覆盖样品。
光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂） 尝试改用其它包埋』材料或其它聚合试剂
在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用） 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定
使用了不适当的固定液，例如一些＠ 酸性固定液 采用推荐的固定液
固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂 用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭

标记率低 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失） 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定
或福尔马林或戊二醛固定。
固▽定时间过长，导致交联程度过高 减少固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
荧光淬灭 Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭，需注意避光操作

促渗条件不佳，以致于试剂不↓能到达靶分子或浓度过低 1、 增加通透剂促渗时间
2、增加通透剂的作ω用温度（15-25℃）
3、优化蛋白酶K的作用浓度和作〇用时间（如：以400ug/ml作用5min）
4、0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。
选择的染料不合适 用溶于0.1M醋酸巴比妥▲的3-5%甲基绿PH4.0，或苏木素复染
染色背∞景很高 支原体污染 请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染
TdT酶的浓度过▂高或反应时间过长 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释或注意控制反应时间
红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。 宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
高速分裂◆和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。 在非高▲增殖期取样检测
DAB孵育时间过长 减少DAB染色时间
Biotin-dUTP的非特々异性结合 在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
阳性对照没有信号↑ DNase I的浓度过低 1、 冷冻切片使用3u/ml的DNase I
2、 石蜡切片使用 1500u/ml的DNase I
3、 一般样本使用10u/ml DNase I
组织样本从载玻片脱落◥ 组织样本被酶从玻片消化下来 降低蛋白酶K的处理时间