碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)（通用型，适用▲于细胞、组织样本）
一、产品简介
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素∮标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细☆胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端◢脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞；由于正常的或正在增殖的※细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能卐够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞↘样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
本试剂盒有如下优点：
1、 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。
2、 操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有Proteinase K 和DAB。
3、 特异性：TUNEL检测时通》常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。
4、 快速：仅需约3个小时即可完成。
5、 应用Ψ 范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
6、 方便观察：使用光学显微镜观察实验结果，无需★贵重设备。
二、试剂盒组份〖
组 份 Cat: BA2020 Cat: BA2050 Cat: BA20100 储存条件
平衡液 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃
TdT酶 80μL 200μL 400μL -20℃
50×蛋白酶 K 40μL 100μL 200μL -20℃
Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避光
Biotin-dUTP 20μL 50μL 100μL -20℃
DAB 2mg 5mg 10 mg -20℃避光
三、试剂盒以外↘自备仪器和试剂
二甲苯、多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等；
盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、光学显微镜、37℃孵箱、移液器等。
四、保存条件：
-20℃保存，Streptavidin-HRP和DAB需避光保存。
五、注意事项：
1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产ξ生的DNA断裂，但不会检测出射ω 线等诱导的DNA断裂(和细胞凋∑亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区〓分开，另一方面也不会把射线】等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细ζ 胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格○判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指←标。
3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
4、因本试剂盒中『组分均为微量，使用前请离心。
5、为避免试验误差、降低试剂◇的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
6、 TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
7、为防︽止样本脱落，请使用硅烷¤（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
8、DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。
9、为了您的安全和健「康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
六、操作规程
A、检测※样本的预处理
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样
本材料及首次试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度▅等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观ㄨ的试验结果。
1、 对于细胞样本
a、 把准备好的细胞涂片或爬片自然晾干。
b、 把晾干的样本浸入固定液，室温（15-25℃）固定15-60min。
（固定液╲的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需→新鲜配制）
c、 把固定好的样本①浸入PBS漂洗3次，每次5min。
d、 把c步处理好◥的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 3%H2O2溶于无水甲醇）
e、 把d步处理好的样『本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
f、 把e步处理好的样本浸入通√透液中，冰上（2-8℃）促渗2min。
（通透液→的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新№鲜配制）
g、 然后转入B步骤标记和♂显色反应。
注意事项：
a、 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
b、 固定』好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟或※过夜，以改善细胞的渗透性。
c、 使用PBS漂洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。
d、 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请︾按上述方法配制。
2、 对于石蜡切片
a、 按常规方⌒ 法将石蜡切片进行脱蜡及水合
（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
c、 把b步处理好的样本加入∏蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。
（蛋白酶K工作液的配制：2μL 50×蛋白酶 K＋98μL PBS）
d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
e、 把d步处理好的样本浸入封々闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）
f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
g、 然后转入B步骤∏标记和显色反应。
注意事项：
a、 蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而◤有所不同，需要自已摸□索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高↓浓度的Proteinase K（400μg/mL）处理5分钟。（本试剂盒的ㄨ50×Proteinase K浓度为1mg/mL）。
b、 其它替□代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法1:
将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
替代方法2：
将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋◣白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于HCl PH2；胰蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）
替代方法3:
将脱蜡及水合好的切片浸入【含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料↓盒中，置于微波炉中→350W（低档）处理5 min。为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
c、 使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反╲应。
3、 对于冷冻↓切片
a、 把冰冻切』片浸入固定液，室温（15-25℃）固定30min。
（固定液的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制）
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次15min。
c、 把b步处理好的样本〖浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）
d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
e、 把d步处理好的样本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促渗2min
（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
f、 然后转入B步骤标记和显色反应。
4、对于难处理的切■片
a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
c、 把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑■料盒中，置于微波炉中750W（高档）处理1 min。
d、 迅速加入80ml双蒸水（20-25℃）加入c步处理好切片的塑料≡盒中，冷却∮至室温，将组织切片转移至PBS（20-25℃）中。
e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）
f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次10min。
g、 然后转入B步骤标记和显色反应。
5、阳性对照及阴性对照的ㄨ准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。
a、阳性对照样本的准备
样本▂在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，细胞样本◥在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（用户自备）室温—37℃处理10 -30 min，其余步骤ぷ均相同。
（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）
b、阴性对照样本的准备
在标】记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。
B、 标记和显色反应：
1、 预处∩理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
2、 配制TdT酶反应液：
参考下表配制适当量的TdT酶反应液（根据需要按照比例放大），需〗充分混匀。注意：配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
平衡液 45μl 225μl 450μl
Biotin-dUTP 1μl 5μl 10μl
TdT酶 4μl 20μl 40μl
TdT酶反应液总体◥积 50μl 250μl 500μl
3、 每个样∩本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加TdT酶）
4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
5、 Streptavidin-HRP及DAB工作液的配制：
Streptavidin-HRP工作液的配制：
参考＠ 下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
Streptavidin-HRP 0.5μl 2.5μl 5μl
PBS 99.5μl 497.5μl 995μl
Streptavidin-HRP工作液总体积 100μl 500μl 1000μl
DAB工作液的配制：
a、先把试剂盒中DAB粉末用PBS溶解配制■成20×DAB（10 mg/ml），配制方法如下：
DAB 2mg 5mg 10mg
PBS 0.2ml 0.5ml 1.0ml
配制成20×DAB（10 mg/ml），放于-20℃保存
b、DAB工作液的配制：
参考下表配制适量的DAB工作液，需充分混匀。注意：配制好的DAB工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
20×DAB（10 mg/ml） 5μl 25μl 50μl
30％H2O2 1μl 5μl 10μl
PBS 94μl 470μl 940
DAB工作液总体积 100μl 500μl 1000μl
6、 将第5步处∮理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干，再滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，加盖玻片37℃湿润避光反︻应30min。
7、 把第6步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
8、 将第7步处理好的样本滴加50μL-100μL DAB工作液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。注意：如果显色很强可以短于5分钟即□ 停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显◥色时间，甚至显△色过夜。
9、 把第8步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光学显微镜下观察、拍照。
10、选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核▲染色。随后用PBS漂洗3次，每次5min，光学显微镜下观察、拍照。
操作注意事项：
1、 PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。
2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜▲，或在湿盒中进行，这∞样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
3、 TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
4、 如果20×DAB溶液颜色变深成◥为紫色，则不可使用，需重新配制。
5、 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色----- 30min ，蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即用蒸馏水▓冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡-----5min。用二甲苯浸泡ぷ-----10min，更换二甲苯后◥再浸泡-----10min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。
