碧波TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）（石蜡切片专用）
一、产品简介
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）(Fluorescence and Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应把荧光素连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3’-OH末端，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞；荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上∩荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜检测；同时荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡切片）的凋亡原位检测。
本试剂盒有如╲下优点：
1、高灵敏度：可以在单细◣胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。
2、特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细№胞。
3、快速：仅需约3小时即可完成︻。
4、操作简单：使用Ready-to-Use型试剂，并配有蛋白酶K和DAB。
5、方便观察：可使用荧光№显微镜观察实验结果，亦可在信号转换后使用光学显微镜观察实验结果。
二、试剂盒组份
组 份 Cat: BA2520 Cat: BA2550 Cat: BA25100 储存条件
平衡液 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃
荧光标记液 20μL 50μL 100μL -20℃避光
TdT酶 80μL 200μL 400μL -20℃
50×蛋白酶K 40μL 100μL 200μL -20℃
anti-fluorescein antibody 200μL 500μL 1000μL -20℃避光
DAB 2mg 5mg 10 mg -20℃避光
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
二甲苯、多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲√基绿等；
盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、荧光显微镜、光学显微镜、37℃孵箱、移液器等。
四、保存条件：
-20℃保存，荧光标记液需避光保存。
五、注意事项：
1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱※导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时╳不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。
3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
4、因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心。
5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
6、 TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
7、DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。
8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴↘一次性手套操作。
六、操作规程
A、检测样本的预处理
TUNEL检测时←样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样
本材料及首次试验结果来调整各个条件，如处理㊣时间、处理浓度等，来优化出适合自》身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
1、 对于石蜡切片
a、 按常规方法将ぷ石蜡切片进行脱蜡及水合
（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱←蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步处∮理好的样本浸入＠ PBS漂洗3次，每次5min。
c、 把b步处理好的样本加入↓蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。
（蛋白酶K工作液的配◥制：2μL 50×蛋白酶 K＋98μL PBS）
d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
e、 把d步处理好的样本浸入封闭液々中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）
f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
g、 然后转入B步骤标记〖和显色反应。
注意事项：
a、 蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调⌒ 整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400μg/mL）处理5分钟。（本试剂盒的50×Proteinase K浓度为1mg/mL）。
b、 其它替☆代方法：石蜡切片的预处理也可根∏椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法1:
将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配①制）
替代方法2：
将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白ㄨ酶中8-10 min（胃蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于HCl PH2；胰蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）
替代方法3:
将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液∑PH= 6 的塑〗料盒中，置于微波♂炉中350W（低档）处理5 min。为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
c、 使用酶处理切片时一定要把酶洗涤∞干净，否则会严※重干扰后续的标记反应。
2、对于难处理的切片
a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。
c、 把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中750W（高档）处理1 min
d、 迅速加入80ml双蒸水（20-25℃）加入c步处理好切片的塑料盒中，冷却至室温，将组织切片转移至PBS（20-25℃）中。
e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。
（封闭液的配制： 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）
f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次10min。
g、 然后转入B步骤标记反应。
5、阳性对照及阴性对照的准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及■阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。
a、阳性对照样本的准备
组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（用户自备）室温～37℃处理10 -30 min，其余步骤均相同。
（DNase I反应液□的配制：10u-3000u DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）
b、阴性对照样本的准备
在标记反应的过︻程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。
B、 标记和显色反应：
1、 预处理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
2、 配制TdT酶反应液：
参考下表配制适当量的TdT酶反应液（根据需□ 要按照比例放大），需充分混匀。注意：配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
平衡液 45μl 225μl 450μl
荧光标记液 1μl 5μl 10μl
TdT酶 4μl 20μl 40μl
TdT酶反应液总体积 50μl 250μl 500μl
3、 每个→样本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性▂对照片不加TdT酶）
4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
5、 荧光显微镜下观察，可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。
可进一步用DAB进行染色观▲察
6、 anti-fluorescein antibody及DAB工作液的配制：
anti-fluorescein antibody工作液的配制：
参考下表配制适量的anti-fluorescein antibody工作液，需充分混匀。注意：配制好的anti-fluorescein antibody工作液必须一『次使用完毕，不宜冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
anti-fluorescein antibody 10μl 50μl 100μl
PBS 40μl 200μl 400μl
anti-fluorescein antibody工作液总体积 50μl 250μl 500μl
DAB工作液的配制：
a、先把试剂盒中DAB粉末用PBS溶解配制成20×DAB（10 mg/ml），配制方法如下：
DAB 2mg 5mg 10mg
PBS 0.2ml 0.5ml 1.0ml
配制成20×DAB（10 mg/ml），放于-20℃保存
b、DAB工作液的配制：
参考下表配制适量的DAB工作液，需充分混匀。注意：配制好的DAB工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
1个样品 5个样品 10个样品
20×DAB（10 mg/ml） 5μl 25μl 50μl
30％H2O2 1μl 5μl 10μl
PBS 94μl 470μl 940
DAB工作液总体积 100μl 500μl 1000μl
7、 将第5步处理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干，再滴加50μL anti-fluorescein antibody工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30min。
8、 把第7步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
9、 将第8步处理好的样本滴加50μL-100μL DAB工作液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。注意：如果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚∮至显色过夜。
10、把第9步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光学显微¤镜下观察、拍照。
11、选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核◥染色。随后用PBS漂洗3次，每次5min，光学显微镜下观察、拍照。
操作注意事项：
1、 PBS清洗后，为了各种反应的有效◢进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。
2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中╳进行，这样可以使反☆应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
3、 TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长∩期保存，长期保存会导酶活性的失活。
4、 如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不♂可使用，需重新配制。
5、 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色----- 30min ，蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即用蒸∏馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡-----5min。用二甲苯浸泡-----10min，更换二甲苯后再浸泡-----10min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。
