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E02229 (48T/96T)
联硕（上海）生物科技有限公司
详细说明
上海联硕生物科技有限公司是国内免疫学产品主要供应商之一，提供各种原装、分装检测ELISA试剂盒,质优价廉，且售后服务完整，有任何试剂盒方面的问题都能帮您解决。免除您的后顾之忧。并可以免费测更好的为您服务。如有其他问题请及时联系我们
产品名称：小鼠载脂蛋白H(Apo-H)ELISA 试剂盒 Kit
规 格： 48T/96T
检测类型：酶联免疫/酶免法（ELISA）
保 存：短期4℃/长期-20℃保存
检测范围：见说明书（来电咨询）
可检测样本：血液标本，组织液标本，尿液标本，粪便标本，脑脊液标本，胸腹↑水标本等（具体详细情况请咨询）
指定供应商：上海联硕生物科技有限公司（国内金牌供应〖商）
ELISA的概念、原理、操作步骤
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定（ Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技→术。此项技术自70年代初问世∑ 以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域＠。
（一） 原理
ELISA是以免疫学反☆应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试々验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果♀的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法（图a）、用于检测抗原的双抗▂体夹心法（图b）以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等ぷ等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
（二） 操作步骤
方法一 用于检∮测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被↑缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量√为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应№孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗〇涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
2. 加样：加一定稀释的待检〓样品0.1ml于上述已¤包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及▲阳性对照孔）。
3. 加■酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后』的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于⌒ 各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依∮据所呈颜色的深浅，以“+"、“-"号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二 用于检测未知抗体≡的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳＠性孔对照）于反◥应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后◥一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法"的4、5、6。
（三） 试剂器材
1. 试剂
（1） 包被缓冲液（PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液）:
NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至∩1000ml
（2） 洗◥涤缓冲液（PH7.4 PBS）：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml
（3） 稀释液:牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 加洗涤缓冲☉液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤＠ 液配成5～10％使用。
（4） 终止液（2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98％）21.7ml。
（5） 底物缓冲液∏（PH5.0磷酸棗柠檬酸）:0.2M Na2HPO4（28.4克／L） 25.7ml 0.1M 柠檬酸（19.2克／L） 24.3ml 加蒸馏水50ml。
（6） TMB（四甲基联》苯胺）使用液:TMB（10mg／5ml无水乙醇） 0.5ml底物缓冲液（PH5.5） 10ml0.75％H2O2 32μl
（7） ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液（PH5.5） 1ml 3％H2O2 2μl
（8） 抗原、抗体和酶标记抗体。
（9） 正常人血清和阳性对照血清。
2. 器材:
（1） 聚苯︻乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
（2） 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
（3） 4℃冰箱，37℃孵育箱。
（四） 注意事项
1. 正式试验时，应分别以ξ阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证√实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反♂应，可采用羊血▃清、兔血清或BSA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
（1） 固相●载体的选择：许多物质可作★为固相载体，如聚氯乙『烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔々平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯〓凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗☉原包被，在同一∑实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附〓性能是否良好。
（2）包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相◥载体表面时，要求纯度要好,吸附←时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg／ml等）进行包被后，在其它试验条件相╲同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说〒通常为1～10μg／ml。
（3） 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直◢接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记ξ 抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法"（包被物、待检样品的参考卐品及酶标记抗体分别为不同ζ的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
（4） 酶的☆底物及供氢体的选择：对供氢体的※选择要求是价廉、安全、有明显♂地显色反应，而本身无色。有些供氢ζ体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应∏注意防护。有』条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反↙应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前▃加入
