[研究方法│新应用│PEA] 使用Handy PEA+测定快速光曲线（RLCs）

　　一、概述

　　自20世纪90年代末以来，快速光曲线（RLCs）已被广泛应用于光合作用研究，其主要使用脉冲调制式荧光仪测定。本应用指南描述的是如何使用Hansatech公司的植物效率分析仪Handy PEA+（连续激发式荧光仪）测定RLCs。

　　二、光合作用研究【中的光曲线

　　多年来，各种类型的光曲线一直被用于光合性能的研究，因为它们可以评估植物当前的光合能力以及在环境光强范围内〖的潜在活性（Ralph & Gademann, 2005）。

　　传统上的光合-光强响应曲线（或P-E曲线，图1）是通过测量不同环境光强下的放氧速率或碳固定速率获取的。

　　图1 光合-光强响应曲线α斜率代表最大的光能利ω用效率，α斜率与光合◆作用最大值Pmax的交点代表∩最小饱和光强（Ik或Ek），反映植物对强光的耐受能力。

　　在超过最适光强后，光合速率下降（虚线部分），这种部分通常被称为光抑制或下调（Masojídek，2021）。

　　稳态光曲线（SSLCs）是一种基于叶∞绿素荧光的测量协议绘︻制的电子传递速率（ETR）与光量子通量密度（PPFD）的函数曲线，并可与ω　传统的P-E曲线相媲美（Houliez et al., 2017）。

　　SSLCs从低光强至高光强依次测量光合速率。每一梯度的时间需要足够长，以便达到在这一梯度的稳态︾光合速率。完成SSLCs协议通常需要几分钟到几〇小时的时间。在野外条件下，当比较不同植物之间的结果时，这就带来◆了巨大的挑战，因√为必须考虑到不同的因素，如ζ测量时间、植物节律和天气变化等（Rascher et al., 2000）。

　　快速光曲线（RLCs）由一系列时间相对较短（＜30s，通常为10s）的光强梯度组成，每一个梯度的光强依次增强（光强梯度由低到高※）。各个梯度之间开饱和▃闪光测定ETR。与P-E光响应曲线或SSLCs不同，RLCs协议在各个光照梯度上不会达到稳态光合速率。P-E曲线显示的是与光反应无关的光合性能的最佳状态，RLCs显示的则是光合性能的当前状态。由于在RLCs中没有达到稳态条件，它们反映了▲在测量之前时期的光适应状态，也反映了较长期的光反应（Ralph & Gademann, 2005）。

　　除了总体光合性能外，RLCs还可提供与通过光系统」II（PSII）的电子传输饱和特性相关的详细信息（Ralph and Gademann, 2005）。

　　用ETR与PPFD作图得RLCs，RLCs中显示三个不同的阶段（图2）。

　　1 光限制阶段

　　在该阶段，光合速率受低光照水平的限制。参数α是ETR相对于PPFD上升的斜率，且其与光捕获效率（有效量子产率或φPSII）成正比（Schreiber, 2004）。

　　2 光饱和阶段

　　在该阶段，电子传递链↙的容量限制了电子传递速率。RLCs在ETR达到最大值时达到平台期（用参数ETRmax表示）（Schreiber, 2004）。最小饱和光强█用参数Ek（或Ik）表示，由α与ETRmax的截距确定（Sakshaug,1997），其与淬灭相关。在Ek以下，光化学淬灭是主要途径，而在Ek以上，非光化学淬灭是主要途径（Henley, 1993）。

　　3 光抑制/下调阶段

　　在这个区域▓，植物受到超饱和光强的照射，RLCs往往趋于下降趋势，这可能与光抑制有关（Henley, 1993）。这种下降效应更可能发生在传统的◥P-E曲线或SSLCs中，因为它们的」光合速率达到了稳态。而RLCs中没有达到稳态，通常没有足够的时间发生光损伤。有人认为，在超饱和光强下ETR的下降可能与PSII的动态下调有关（White and Critchley, 1999）。

　　图2 RLCs的三个阶段A-光限制阶段；B-光饱和阶段；C-光抑制/下调阶段

　　三、快速光←曲线的测定

　　RLCs协议通常以不超过10秒的初始准黑暗期开始。这允许初级电子受体（QA）的快速再氧化，而非光化学淬灭系〓数没有实质性的弛豫（Schreiber, 2004）。这与长时间的完全暗适应期形成对比，如在快速叶绿素荧光诱导曲线测量中使用的几分钟或更长时间的暗【适应。在完全的暗适应下，光反应和暗反应变得不活跃，导致光系统的完全再氧化（Rascher et al., 2000）。如果PSI和PSII发生完全的再氧化，RLCs协议中的照明将产生诱导效应，使数据的解释更加复杂。

　　准黑暗期之后紧接着是一个饱和闪光。随后是一个逐步增加的光化周∴期梯度，每个周期◢之后是一个饱和闪光。光化周期的典型持①续时间为每个10秒。

　　光化光梯度的理想设置是在光限制、光饱和与光抑制三个区域中的每一个区域都生成几个数据点。对于弱光条件下光合作用更强的样品，在光限制区域测量更多的数据点有利于更好地估计α参数。如果↑样品耐强光，那么在光饱和与光抑制区域测量更多的数据点将提供更有趣的结果。

　　四、使用Handy PEA+测定RLCs

　　Handy PEA+软件的协议√编辑器，特别是ζ其预照光功能，可用于测量与非调◆制式荧光仪相关的更典型参数和协议，如φPSII (Y(II))，ETR，NPQ和淬灭分析模型等。

　　您可以在Hansatech公司网站（Support>Applications）上下载提供的示例协议开始RLC测量。或者您可以安装和修改示例协议，也可※以从头创建协议。网址为http://www.hansatech-instruments.com/hil-application-notes/。

　　关于命名法有一个重要的提示。因为Handy PEA+的控∴制和分析软件PEA plus目前假定已经执行了一个暗适应协议，它将默认地对其分析工具中的测量参数应用暗适应命名法。

　　Hansatech公司网站上提供了一个Excel表格，用于执行解释RLCs数据所需的图形和统计分析。在将Handy PEA+数据导出到电子表∏格后，可以根据表1进行相应的参数命名调整转换。

表1 使用Handy PEA+测定的RLC参数卐默认命名的转换

　　使用示例协议

　　1 下载示例协议到您的电脑；

　　2 将Handy PEA+连接到电脑；

　　3 打开电脑上的PEA plus软件；

　　4 通过“Handy PEA>Select Com Port”菜单选项，选择电脑给Handy PEA+分配的com端口；

　　5 通过“Handy PEA>Protocol Editor”菜单选项，打开Protocol Editor协议编辑器；

　　6 在Protocol Editor协议编辑器①中，选择“File>Open”；

　　7 导航至电脑上的示例协议，点击“Open”；

　　8 在Protocol Editor协议编辑器的∑　左侧，点击“Setup”按钮；

　　9 进入“Multi Recording”窗口，在“Before Recording”区域的“illumination”定义RLCs的光化光梯度光强。

图3 Protocol Editor协议编辑器中的Multi Recording窗口

　　10 在Protocol Editor协议编辑器的左侧，点击“Upload”按钮；

　　11 在Handy PEA+上选择一个可用的协议位并接受；

　　12 在Handy PEA+仪器上选择并运行协议。

　　从头创建RLC协议

　　请按照以下步骤在PEA plus软件中创建RLC协议。

　　1 在PEA plus软件中，打开Handy PEA+协议编辑器；

　　2 点击“Title”按钮并定义协议的】名称；

　　3 点击“Gain”按钮，为您的协议调整增▼益至合适的水平，默认为1；

　　4 在Protocol Editor协议编辑器的左侧，勾选“Multi Recording”选项，并选择RLC所需的记录数量（即光化光梯度）；

　　5 将“Before Recording”中的“Duration”设置为＜30s（推荐10s）；

　　6 将Number1对应的illumination数值设置为0，来实现准黑暗期；

　　7 在随后的illumination框中，设置一组光化光梯度光强，以覆盖◎光限制、光饱㊣　和光抑制三个区域；

　　8 在“Recording”区域，将“Duration”设置为1s；

　　9 在“Recording”区域，将所有illumination数值设置为＞3000umol/m2/s；

　　10 将协议上传至Handy PEA+。

　　运行RLC协议

　　1 在Handy PEA+仪器上，导航到协议菜单（System>Protocol），选择上传的协议进行查看设置；

　　2 点击“Reset”按钮，返回主菜单；

　　3 通过“System>Configure>More”导航至警报设置界面，将Warnings改为No。因为RLC测量过程除了最初的饱和脉冲测量之外，后续测量都将出现●较低的Fm和Fv/Fm，这ω　是必然的，所以测量警报是不必要的；

　　4 确保其他所有设置，如ID Entry，Gain，Autosave等设置符合您的实验要求；

　　5 在所测样品上放置Handy PEA+暗适应叶夹，不要关闭遮光片，因为光系统的完全再氧化会导致RLC产生诱导效应，是数据更加复杂（Rascher et al., 2000）；

　　6 将Handy PEA+探々头安装到叶夹上，并尽快开始∞测量，以避免样品长时间的暗适应ぷ，测量过程中要确保样品稳定地保持在叶夹内的位置上；

　　7 测量完成后，依次保存数据，并将Handy PEA+连接到电脑下载记录的数据。

　　分析RLC数据

　　如上所述，PEA plus软件默认测量数据已经执行了暗适应，并在此基础上应用命名法。在RLC协议期间测量的数据来【自光适应后的样品，因此，对于协议期间进行的每一次测量，PEA plus软件中显示的参数应当重新标记，如表1。

　　PEA plus软件目前不提供解释RLC数据所需的图形和统计分析。但是，Hansatech公司网站上提供一个Excel表格，Handy PEA+测量的RLC数据可复制粘贴至其中，进行处理。

　　RLC模板采用Platt等人（1980）的方程将Handy PEA+测量的原始数据建模曲线。该模板要求在Excel中启用解算器插件。解算器插件使用GRG非线性方法※最小化误差平方和（SSE），用于计◤算最佳解/拟合。

　　该模板包括一些示例RLC分析工作表，以供参考（图4）。

图4 RLC数据处理模板

　　该模板可从Hansatech网站的“Support>Applications”页面下载。网址为具体操作步骤如下。

　　1 确保PEA plus软件的Summary选项卡内显示来自RLC协议的▆所有测量记录；

　　2 打开Parameters选项卡，确保显示参数Fo和Fm。如果未显示，可通过“Tools>’Parameter View’Parameters”启用；

　　3 将空白RLC模板复制■到新的工作表中；

　　4 在“Measured parameters”下的F（Fs）这一列内输入对应的Fo；

　　5 在“Measured parameters”下的Fm’这一列内输入对应的Fm；

　　6 在“Measured parameters”下的PAR这一列输入PEA plus软件的Settings选项卡内对应的“P.Light”，如果未显示“P.Light”，则在PEA plus软件左侧的“Preferences”区域勾选“lp”即可显示；

　　7 φPSII和ETR的值是→自动计算的，ETR是使用单元格※B8和B9中定义的常数来计算的ㄨ，PFDa和FractionPSII分别设置为0.84和0.5，如果有需要，可更改；

　　8 依次将“Measured parameters”下的PAR、F（Fs）和Fm’对应的P.Light、Fo和Fm输入，φPSII和ETR将自动计算完毕；

　　9 点击“Plot curve”按钮运行解算器，这将最小化误差平方和（SSE），并生成一条曲线，ETRs、α、β、ETRmax和Ek的最佳拟合值也★被计算出。

　　参考文献：

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