拉曼光谱技术
近年来,拉曼光谱和成像技术, 得益于其相对于红外光谱技术优异的空间分辨率等优势,在研究样品的分子振动方向得到了广泛的应用,尤其是生物样品,因为水中的拉曼光谱背景信号更弱。相干拉曼散射显微技术(Coherent Raman scattering microscopy)近些年也得到了大力的发展,其基于相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering)或⌒受激拉曼散射(stimulated Raman scattering),大大改善拉曼的成像∏速度。例如,蛋白质和脂肪在皮肤内的分布情况,可以通过△两者在C-H伸缩振动区特征的拉曼谱带进行视频级的高速成像来获得。
然而拉曼光谱和成像技术也存在着自身的一些不足:
(1)较低的拉曼散射截面,尤其是在指纹区,相对于红外技〓术弱5-10倍;
(2)会受●到荧光的干扰,由于拉曼信号偏弱,一些〗样品的荧光信号又宽又强,会一定程度上覆盖拉︾曼信号;
光学光热红外技术Ψ
基于光学-光热红外技术(O-PTIR)的亚微米分辨率红外拉⊙曼同步测量系统mIRage,使用宽可调谐的脉冲红外激光源激发样品,在样品中产∏生调制光热效应。通过@光热效应提取并计算红外吸收, 通过检测反射探头光束强度的变化作】为红外波数调谐的函数,从而提供红外吸收光谱。这种短波长脉冲探测光束(通常是532 nm)决定了红外测试空间分辨率,而不∞是传统FTIR/QCL显微镜中依赖的红外波长。由▲于其独特的系统架构,短波长探测光束同样也能作为一个拉曼激①光源,当集成拉曼光谱仪,mIRage系统可以◤提供同一地点,同一时间,同一空间分辨率的亚微米红外+拉曼显微镜的检测结果。
mIRage光谱的显著优势:
1. 和拉曼光谱一致的亚微≡米空间分辨率,比传统FTIR/QCL显微镜提高30倍,达到500 nm;
2. 非接触式测量,非破坏性,反射(远场)模式测量,无须复杂的样品制备;
3. 高质量光谱(测试可兼容粒子〓形状/尺寸和表面粗◥糙度),没有色散/散射伪影问题;
4. 可直接在商业数据库中匹配搜索
5. 可实现红外和拉曼光谱成像同步测量
单细胞光谱与成像——拉曼光谱技术 vs.光学光热红外技术
如上文所述,拉曼散射的横截面在指〓纹区相对于红外弱≡五到十倍,即相比于拉曼散射,红外吸收在指纹区域比在高波数C─H和O─H拉伸区有更大的横截面。以PMMA为例,C-H振动模式在3.39 μm的线性吸收系数为1396 cm?1,而在指纹区域,C=O拉伸振⊙动模式在5.78 μm的线性吸收系数可达到7904 cm?1,约高6倍。PMMA的红外光谱和拉曼光谱的直接对㊣比如下所示。指纹区域较大的红外吸【收截面可以允许mIRage显微镜对单一病毒进行振动光谱的检测分析,而这对拉曼或相关拉曼【光谱来说十分困难。在相同的激》光功率和采集时间下,mIRage中红外显微镜比拉曼光谱具有更高的信噪比,进一步可以用于检测细菌对抗生素红霉素等药物的反应。综上所述,两种振动光谱技术并没有相互竞争,而是提供了互补的信息,现在越来越多的趋势¤倾向于同时获取拉曼光谱和红外光谱来全面研〒究样品的◇分子振动信息。
参考文献:
Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect,Sci. Adv. 2021; 7 : eabg1559.
具体案例:
1. 同位素标记的大肠杆菌单细菌细胞的mIRage显微红外谱图与成像
近期,英国利物浦大学Roy Goodacre教授分享了关于同位素标记的细菌的振动光谱研究成果。该研究借助于单细胞╳亚微米分辨率红外拉曼同步测量系统mIRage,通过红外光谱□ 和成像分析,来揭示细〖菌代谢的过程和机理,不仅包含细菌群╱落,还包含微生物之间的相互作用。由于传统显微红外光谱◆仪的空间分辨率较低,目前多数研究都集中在细胞群落的评估上,而该研究作为一个重大的突破,首次使用亚微米光热红外光谱技术在单细胞水平上评估细菌对标记ω化合物的吞并行◆为过程。
参考文献:
Imaging Isotopically Labeled Bacteria at the Single-Cell Level Using High-Resolution Optical Infrared Photothermal Spectroscopy,Anal. Chem. 2021, 93, 6,3082-3088.
2. mIRage显微红外谱与∑ Raman光谱协同分析固定或活的单细胞
英国曼彻斯特大学的Peter Gardner教授近期发表了他们关于活(和固定)细胞振动光谱分↘析的新研究结果。他们使用亚微米分辨的mIRage红外光谱及拉曼显微镜,并借助于两个激发ω 源(QCL和OPO激光器),对细胞进行了宽光∏谱范围的覆盖,从而使所有与生物学相关的分⊙子振动都能『被检测到,且保持一致的亚微米的空间分辨率。此外,红外光谱采集与拉曼光谱有效的结合起来,在相同的激发位置,形成振动互补,得到一套完整的振动光谱信息。如下图所示,该红外和▲拉曼的组合方式可以用来分析液体环境中固定或活细胞的亚细胞结构,其中的〓蛋白质二次结构及富脂体均可以在亚微米尺度上被有效地◎识别出来。
参考文献:
Analysis of Fixed and Live Single Cells Using Optical Photothermal Infrared with Concomitant Raman Spectroscopy,Anal. Chem. 2021, 93, 8, 3938–3950.
3. 亚微米分辨红外拉曼同步测量系统mIRage用于微塑料鉴定等相关领域
美国特拉华大学Isao Noda教授课题组≡与Photothermal Spectroscopy Corp公司合作,利用基于光学光热红外技术的新一代非接↓触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统mIRage对聚乳酸(PLA)和聚♀羟基烷酸酯(PHA)的复合薄片进行红外拉曼同步〓成像分析,探究这两种材料结合的方式和内在机理。为探求界面处PHA/PLA组分的空间分布规律,同步和异步二维相关光谱(2D-COS,two-dimensional correlation spectroscopy)被用来分析羰基拉伸区域采集到的红外谱¤图。结果显示,在主要为PHA的混合」界面区域同时观测到来源于PLA的1760 cm-1红峰外,表明部分PLA渗透到PHA层,且与PHA层的其余部分相比,界※面附近的PHA结晶度明显降←低。另外,作者◤还通过mIRage对该区域进行了同步红外和拉曼分析,两者选ぷ择性和灵敏度不同却可以很好的互补,进一步验证了这一发现的可靠性。结果证实,即使是表面上不混相的PHA和PLA聚合物对,也存在一定程度的分子混合,这种混合可能发ξ 生在界面只有几百纳米的空间水平上,很好的解释了这●两种生物塑料之间的高度相容性。
参考文献:
Two-dimensional correlation analysis of highly spatially resolved simultaneous IR and Raman spectral imaging of bioplastics composite using optical photothermal Infrared and Raman spectroscopy,Journal of Molecular Structure, DOI: 10.1016/j.molstruc.2020.128045.
总结
亚微米分辨红外拉曼同步测量系统mIRage作为一种新型的红外光谱技术,具有传统FTIR显微镜不可比拟的优点,并克服了许多限制。首先,mIRage可以提供空间分辨率约为500 nm的红外◇谱图,远远超过了典型的红外衍射极限空间分辨率,且不依赖于入射红外波长。更←重要的是,它能够以反射/非接触(远场)工作模式简单快速的生成高质量的类似于FTIR的谱图,从而避免了制备样本薄切片的必要,且光谱与商用FTIR数据库搜索完全兼容和可译。另外,即使︼样品中包含易产生荧光干扰的组分(压ξ 制拉曼信号或造成其饱和),mIRage的可调制信号收集特性也确保它完全不受任何荧光□ 的影响。IR和Raman在mIRage方法的■结合下,可以充分利用这两种互补性技术的优势,实现同步的红外吸收和拉曼散射测量,并相互印证。
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