本文转载自 北大生科院仪器中心
多功能单ω细胞显微操作系统FluidFM BOT，是将原子力系统、微流控系统、细胞培养系统合为一体的单细胞操作系统，采用不同孔径的微型纳米注射器，可实现单细胞注射（Injection）、活细胞内物质提『取（Extraction）、单细胞分离（Isolation）、粘附力测定（Adhesion）、纳米打印(Nano-printing)等多种功能，更多功能及应用请参考如下文章。
点击了解更多详情：多功能单★细胞显微操作系统FluidFM BOT的原理与应用介绍
本次◎讲座与培训将介绍FluidFM技〖术的原理及应用，着重讲解在活细胞单细胞组学领域的进展，Live-Seq技术可直接在活细胞无损提取细胞内容物进行ξ 测序工作，能够提∏供更加原生和真实的测序信息，让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。
报告信息：
应用讲座：
5月25日
北京大学金ζ 光楼︾311上午09:30—10:30
上机培训（扫码报名，名额有限）：
5月25日
北京大学金光楼126下午13:00—17:30
报告人:胡西 博士
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报告人简介：
胡西，Application Scientist of Quantum Design China，加州大学洛杉矶分校博士后。主要负责单细胞显微操作设备的技术▲支持和市场推广活动，并具有丰富的流体力々显微镜（FluidFM）的操作经ぷ验。
主办单位：凤凰工程北大基地光学成像平♀台
协办单位：Quantum Design 中国
科研进展文章导读：
单细︼胞测序在疾病诊断和细胞异质性研究中发挥◣着重要作用。然而目前的单细胞测序手段需要将细胞消化并裂解才能够进№行，而细胞状态在这一操作█中不可避免的会发生改变，因此很难掌握细胞真实的基因表达情况， 尤其对于基因通路上表达变化的检↑测极为不◣利。近期苏黎世联邦理工学院使用》FluidFM创建了一种原√位活细胞基因测序方法，这种方法能够在不杀死细胞的情况下完成对细胞的测序工作「。通过这种技术该团队成功完成单细胞RNA基因测序，并通过这种方法检测到了细胞的基因表达和细胞周期状态变化。下※面本文就这项工作的具体内容进行阐述。
1. Live-Seq测序技ㄨ术简述
由于单◤个细胞的RNA总量仅有10 pg。为了实现无损的单细胞测序，该团队首先使用∞FluidFM对现有的scRNA-Seq单细胞测序的方法进▅行了优化。为了尽可能的接近Smart-Seq的测试条件，该团队采用了首先将缓冲液吸入探针，然后再进行细胞提取的操▆作。这样可以确保所提取的RNA能够首先与缓冲液混▆合，从而避免RNA的降解。通过这一方法，该团队〇成功实现了IBA细胞的测序，证■明了这种方法的可行性（图1）。
图1. Live-Seq技术a. Live-Seq技术的〒示意图和代表图片，黑色箭头指代液〗面；b. IBA细胞测序的质量控制图（n=10）。
2. Live-Seq技术分析细胞系和细胞状态
为了证实Live-Seq的有效性，该团队对多→种细胞系进行了测序，这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进¤行测序发现，该方法能够区分上述细胞系，并且在特征基因检测□ 中能够找到每种细胞所对应的特征基因，证明了Live-Seq方法的有效性▲（图2）。
图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态a. 实验方法示意图，使用LPS和PBS对RAW细胞进行♀处理；b. 前500个高度易变基因的tSNE图；c. 前十◎的细胞型、细胞状态差别基因的热图；d. 小鼠基因图谱预测，使用前100个标记基因的团簇；e. Live-Seq对比scRNA-Seq的锚点分析，显示两者没有显著差异。
3. Live-Seq技术对细◥胞的活力基本没有影响
Live-Seq技术的优势在于提取过程中不会破坏细胞。通过对¤提取前后的测序对比可以发现，提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过♀对细胞形态的观察中，发现细胞的形态基∏本没有改变，并且多数细胞仍然能够正常分裂（图3）。
图3. Live-Seq对细∮胞活力的影响a. 细胞实验的示意图；b. Live-Seq测序后不同时①间点（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE图；c.不同时间点scRNA-Seq所有能够发现差异的基因（共12个）；d.不同时间点的细胞形态图片。
4. Live-Seq技术能够记录细胞下游分子表型事件
由于Live-Seq对细胞生理状态影响小，因此能够监测在细胞代谢过ㄨ程中的基因变化。通过对比LPS处理的巨噬细胞周期实验中发现，Live-seq技术与对照组的细胞代谢水█平相比没有☉明显变化，因此这种方法测量的数据十分∮接近细胞代↓谢中基因表达的真实水平。通过测序对比LPS处理与空白的测序结果发现Nfkbia与Tnf的表达相△关程度至高。这一结果也验证这种测序方法在检测细胞下游表型时的优势。
图4. Live-Seq技术的单细胞纵向分析a. 实验示意图；b. 不同处理细胞的mCherry强度变化；c. 3~7.5h之间mCherry强度变化；d. Tnf-mCherry强度变化的线性回归模型；e. Nfkbia与Tnf在Live-Seq测序中的←表达关系；f. Nfkbia与Tnf在scRNA-Seq测序中的表达关系；g. Live-Seq测序←中细胞处于S期的评分；h. Live-Seq测序中细胞周期的mTnf-mCherry强度变化；i.Tnf-mCherry的荧光强度增量（3~7.5h）。
5. Live-Seq技术对同一细胞多次卐测序
Live-Seq技术的无损性甚至能够实现对单个细胞的多次测序。通过对单个细胞两次提取后细胞活力变化的观察中发现，细胞的活力即使在2次提取后仍没有发生明显的变化，基因型分析也没有发现明显的基因表型改变。
图5. Live-Seq对细胞的多次提取j.连续测序的示意图和代表图像；k.Live-Seq的tSNE图；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE图。
6. 总结
Live-Seq是一＠ 种十分具有前景的单细胞测序的新方法，得益于FluidFM技术的无损提取的优势，Live-Seq技术除了能够实现传统测↓序的功能外，还降低了细胞的损伤，能够提供更加原生和真实的测序信息。这种特点甚至让⌒单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信随着这种技术自动化的提高，将为单细胞测序技术带来更多可能。
参考文献：
[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. G?belein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752；
doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752
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