注意：正式测定◇之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
NP在一定的温度和中性pH条件下，催化水解蛋白质。由于其▽安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。
测定原理：
中性条件№下，NP催化酪蛋白水解产生酪』氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。
自备仪器和用品：
可见分光光∩度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌♂器Ψ 、可调式移液枪、1.5mL EP管和蒸馏水。
试◤剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加4mL蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入4mL试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加20mL蒸馏水溶解。
试剂五：液体×1 瓶，4℃保存。
标准品：液体×1 支，0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提⊙取：
1. 组织：按照组织▂质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
2. 血清或培养液：直接测定。
3. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞∞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：
1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。
3.对照管：取0.5mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL试剂二，混匀╲后置于30℃水浴保温10min；加入40μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后㊣ 置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量♀玻璃比色皿/96 孔板，于680nm测定光吸收，记为A对照管。
4.测定管：取0.5mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL试剂三，混匀↓后置于30℃水浴保温10min；加入40μL试剂二，混匀后10000rpm 4℃离心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量◥玻璃比色皿◣/96 孔板，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与空白管不同○，先加试剂三█，后加试剂二）
5.空白管：取0.5mL EP管，加入40μL蒸馏水，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A空白管。
6.标准管：取0.5mL EP管，加入40μL标准品，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A标准管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算〖公式如下
（1）按蛋白浓度计算
NP活性单位¤定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活☆单位。
NP活性（nmol/min/mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr
（2）按样♂本质量计算
NP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单※位。
NP活性（nmol/min /g）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
（3）按照液体体积计⌒ 算
NP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单▓位。
NP活性（nmol/min/mL）=C 标准品×（A测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷V1÷T= 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）
（4）按照细胞数量计算
NP活性单位定义：30℃每104个细胞⊙每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min /104cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（细胞数量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量
C 标准品：0.25 μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议
称取同样质量的样品，加入1mL 蒸馏水匀浆提取离】心后，用本公①司蛋白质含量测定试剂盒
测定；W：样品质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10 -2mL；V2：
粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应〗时间（min），10min。
b.使用96 孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
NP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min /mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr
（2）按样本质量计算
NP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min/g）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W
（3）按照液体体积计算
NP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min/mL）=C 标准品×（A测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷V1÷T= 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）
（4）按照细胞数量计算
NP活性单位定义：30℃每104个细胞每分钟催化水解产ぷ生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min /104cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（细胞数量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量
C 标准品：0.25 μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议
称取同样质量的样品，加入1mL 蒸馏水匀浆↘提取离心后，用本公╳司蛋白质含量测定试剂盒测定；W：样品质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10-2mL；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化ξ反应时间（min），10min。
注意事项：
临用前配制的试剂配制好后4℃保存，并且3 天内使」用完毕。
