1）膜蛋白的结构形成过〖程研究
成孔毒素（Pore-forming toxin, PFT）能在靶细胞膜上寡聚化形成穿膜通道, 破坏细胞膜结构并使其渗透性增强而导致细胞渗透性溶解。 PFT寡聚体在细胞膜上可以连接形成密排六方结构（hcp）。
Lysenin是来源于蚯蚓的一种PFT，可在鞘磷脂/胆固醇（SM/chol）双层膜结构中寡聚化并形成hcp。实验中，研究人员使用了日本RIBM的超高速视频♂原子力显微镜（HS-AFM），对SM/chol双层膜结构中lysenin寡★聚体组装成hcp的动态过程进行了实时成像，发现了hcp结构形成】的规律。
研究人员将lysenin与SM/chol双层膜结构在云母为基底的环境下共同培养后使用HS-AFM进行成像。下图显示了lysenin寡聚体形成的hcp在膜结构上的分布。白色六边形表示一个hcp单元，箭头〖表示未完全形成的寡聚体。通过计算可以获得Hcp单元的间距和寡聚体直径等数据，与之前使用电镜的研究获得的数据一致。
通过HS-AFM还︾可以获得lysenin寡聚体的三维图像。对各个寡聚体的高度数据进行统计，可以发现高度分布主☉要为两种，高度较低的寡聚体已经嵌入了膜结构中，并〗可能形成了核孔。
接下来研究人员对400×300nm区域内的SM/chol双层膜结构上的lysenin组装过程々进行了动态成像。图A展示了lysenin簇的形成并可以检测簇的增长方向（图B），终组装形成hcp结构。
在黑色的云母基底上也¤能观察到lysenin，分析双层膜结构上和基底上的lysenin半径大小可以∴得出，双层膜结构上的lysenin形成了寡聚体进而组成hcp结构，而基底上的lysenin处于单体或不规则聚集形态，无法形成寡聚体，这也与之前的研究结果一致。
对视野内的lysenin簇如B图进行划分并进一步分析可以得出：
1. Lysenin形成单个簇后，在双层膜【上水平扩散，聚集排列形成hcp结构；
2. 新形成的簇会组成新的矩形排列（彩色矩形）或填充到已有的矩形排列的空缺处，有些已经形成的簇会在膜上扩散或分解；
3. 矩形排列√的方向可变（如上方红色≡矩形）；
4. 绝大多数Lysenin簇在装配开始就会聚集形成簇，而不是随机分布在膜上。
HS-AFM还可以在更高ㄨ的放大倍数下以更高速率成像，以实现对lysenin簇组装成hcp结构的动态进行更详细的检测。
通过对结※果的分析可以得出，大部分从外围结合到hcp结构区域的簇会以平均0.45秒的时间分解，而已经形成hcp结构的则相对←更加稳定，可能原因是内部的lysenin寡聚体相互之间具有更多的结合位点，更难以分解№。
小结：高速AFM成像♂可用于lysenin形成hcp结构的动态过程的研究。lysenin簇■于膜上形成，经过大量的分解\重组和扩散形成hcp结构，随着膜上hcp数量的增多而趋向于稳定。同时，我们还可以获得簇√的高度信息，用于表征lysenin与膜的结合╲以及穿膜通道的形成。
2）膜蛋白的结构形成机制研究
膜联蛋白（Annexin）是于真核细胞的细胞质内普遍存在的一种蛋白→，与多种细胞膜功㊣ 能相关，如胞吞、胞吐以及离子转运〗等。膜联蛋白在钙离子环境下可结合至磷脂，进行细胞膜修复等作用，但至今对于膜联蛋白-钙离子-磷脂三者的组装与分解的动态过程的研究仍处于空白〓。
这项研究中，研究人员使用日本RIBM的超高速视频原子力显㊣微镜（HS-AFM）引导了膜联蛋白V（A5）的组装与分解并ω 进行成像，分析了过程中的蛋白结构，动力学和分子间相互作】用。
研究人员先将双层脂膜加入含2mM钙离子的缓冲液，再加入A5并用HS-AFM成像。可以观】察到A5三聚体在膜上形成了六边形晶格结构（标记1），并在中间含有纵向高度更低的三聚体（标记2）或者空洞（标记3），这与先前使用其他AFM和电镜的结果相一致。
HS-AFM可以进行每秒几十帧的更高速度的成像。对上◎图中标记2的区域进行高速成像，三聚体依然保持了相似的尺寸和高度。在高速成像下，研究人员次发现三聚体的方向会发生变化：向上（0°）和向下（60°）。此A5三聚体与其他形成了六边形晶格结构的三聚体相比，分子间相互作用更弱，使其能够改变方向。
传统的AFM和电镜获得的图像是时间或空间的平均图像，无法记录短时间内的变化，因此难以发现三↘聚体方向的改变。通过HS-AFM的高速实时成像才发现并捕捉到了这一现象。
HS-AFM还可以与微流系统和激光等其他仪器结合，在实验过程中对样品和环境进行更多操作并实Ψ时成像，可以对卐两种A5三聚体的组装与分解进行更加深入、详细□的研究。
研究人员使用微流系统可向实验环境加入EDTA,可以降低钙离子含々量，使三聚体形成的晶格结构分∮解，同时，通过控制的流量可以地计算出加入EDTA的含量进行定量分析；整合的高精度紫外激光，可以对钙离子笼锁化合物进行解笼锁操作，使其在实Ψ 验过程中可以多次反复释放钙离子。
起初，我们可以清晰地观察到晶格结构；277s时缓慢加入40mM EDTA后，晶格结构分解；441s时启动紫外激光，解笼锁发生释放出钙离子，晶格结构重新组▅装；870s时关闭激光，晶格结构再次开始分解。
进一步提高放大倍数后进行高分辨率成像，可以⊙发现加入EDTA后，非六边形晶格的A5三聚体相对于形成了六边形晶格结构的三聚体分解№更快，对于钙离子含量下降更加敏感。
小结：通过HS-AFM的高速、高分辨率成像以及与其他仪器的联用，在体外构建了实时生化反∞应环境，在对蛋白结构直接成像的同时，发现了构成膜联蛋白结构的两种不同状态的蛋白↓三聚体的差异，同时证明了钙离子在蛋白组装过程中的←必要性。
3）膜蛋白的跨膜运动机制研究
谷氨酸盐跨膜转运蛋白（GltPh）的主要作用是通过跨膜转运谷』氨酸盐，将突触间隙的谷氨酸盐浓度保持在兴奋性毒性以下，防止神经元死亡ζ 导致神经系统疾病如癫痫、老年痴呆等。
GltPh如右图所示，由一个固定在膜上的三聚体结构域（橙色）和一个转运结♀构域（蓝色）组成。在有钠离子和谷氨酸的环境下，转运结构域可移动至膜的对侧来转运谷氨酸盐；在无▓基底的环境下，转运→结构域也可以跨膜移动。
之前，GltPh的直接动态成像很难实现，RIBM的超高速视ω 频原子力显微镜（HS-AFM）攻克了这一难关，向我们展示了GltPh的跨膜升○降运动。
实验开始前，研究人员将GltPh纯化后与脂类组成的囊泡整合成跨膜结构，并用HS-AFM观察。
在无基底的环境下，GltPh的三聚体结构清晰可见。当每︽个转运结构域暴露在胞外的部分朝向显微镜的探针，即处于上升（up）状态，突出的部分形成了一个三角形，中间则』形成空洞（t=57s）；每个转〖运结构域也可朝向胞内（t=58s），此时处于下降（down）状态。
环¤境中单加入钠盐时，GltPh处于上升状◥态的平均时间为33s，这意味着GltPh仅结合Na 离子时跨膜运动受到抑制。
加入充足的钠盐和≡谷氨酸，使环︾境浓度达到饱和后，GltPh处于上升状态的平均时间为 11.1 s，开始进行活跃的跨膜转运活动。
以上的结果证实了，当Na 和谷氨酸同时存在或缺失时，GltPh的跨膜运动相对于仅有Na 时更加活◣跃，GltPh是Na 和谷氨酸的协同转运载体。
HS-AFM在进行高速成像的同时，保持了很高的空间分辨率，可以清晰地分辨三聚体的每一个结构域，使得我们可以对不同结构域运动之间的关系进行研究。
我们针对①一个GltPh三聚体，通过视频统计的数据计算了其处于不同状态（结▂构域处于上升状态的数量）的概率，结果与使用自由能公式计算出来的概率一致。
进一步对结构域运动的关系进行统计，可以得出三聚体的结构域之间运动ㄨ是相互立的，这也直接验证了之前的研究结果。
小结：使用HS-AFM获得的高空间&时间分辨率的视频图像，可以准确地反应生物大分子的运动状态，用于定♂量研究。
