FuGENE6（Roche）转染步骤：转染前一天将细胞分至培养板，转染当天】细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。2.将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管】壁混合。3.加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。4.室温孵育20分钟。5.将6孔板中的♂旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。7.3-8小时后，加入血清或换○成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转ㄨ染日密度为90-95％。细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。2.对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻々混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分〗钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。4.混合稀释＠ 的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基▂。6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板◤，轻轻混匀。7.在37℃，5％CO2中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。或者在4-5小时后更换培养生长基◣也不会降低转染活性。8.在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数■天或数周。贴壁细胞≡的稳定转染：转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养＠基。 Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数（0.5-2×105），细胞铺板，使其在转↓染日密度为90-95％。细胞铺板在0.5 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。2.对于每孔细胞，使用50 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释0.8-1.0 ugDNA，轻轻混匀。3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用50ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释1-3 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。5.（optional）将24孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入0.5ml无血清配养基。6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。7.在37℃，5％CO2中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。8.在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。贴壁细胞的稳定转染：转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。 Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤：以下步骤适用▽于在6孔培养板中转染ξ　贴壁细胞。开始时，每6孔培养板使用0.4 ug DNA。尽管DNA的量看起来很少，但已足够用于转染。如果▓想获得最高的转染效率，对每种细胞系的转染々条件都要进行优化。1.转染前一天，用5ml含血清和♀抗生素的培养基分装使每6孔培养板含2-8×105的细胞（根据细胞类型而定）。2.在细胞的正常培养条件下培养（通常37℃和5％CO2）。转染当天细胞应40-80％融合。3.转染时，用DNA浓缩缓冲液（EC Buffer）稀释1 ug DNA至100 ul总体积（DNA用pH 7-8的TE Buffer溶解，DNA最低浓度：0.1ug/ul）。加入3.2 ul Enhancer，涡旋1s以混合溶液。重要：请保持DNA与Enhancer比例恒定。注意：质粒DNA的质量会显著影响几个转染参∮数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结♀果的解释。因此，只应该使用最高纯度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提纯化的质粒适合于≡大多数细胞系的转染。要获得最好的重复性和最好的结果，我们推▲荐使用Endofree Plasmid Kit，该试剂盒可以快速有效地在质粒纯化过程中去除细菌内毒素，从而获□得最佳的转染结果。4.室温（15-25℃）孵育2-5分钟，离心（spin down）几秒钟以从管顶去除液滴。5.向DNA-Enhance混合液中加∮入10ul Effectene Transfection Reagent，反复吸取5次或涡旋10秒钟以混合。注意：没必要一直把Effectene Reagent置于冰上。在室温中放置10-15分钟不会改◥变它的稳定性。6.室温下（15-25℃）孵育5-10分钟以形成转染复合物。7.孵↓育过程中，从培养板上轻柔№地吸出培养液，用4 ml PBS洗涤一▲次细胞。加入1.6 ml新鲜培养液（可以包含血清和抗◢生素）到细胞中。8.加入0.6 ml培养液（可以包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的EP管中。吸取两次以混合，立即将转染复合物drop-wise加入6孔培养板的细胞№中。轻摇培养板使转染复合物分布均々匀。9.将细胞与转染↑复合物在它们的正常培养条件下孵育适当的时间直至转染基因表达。孵育时间和由所采用的实验和所使用的基因决定。 Optional: 大多数情况下，不需去除转染复合物。然而，如果观察到细胞毒性，则需在转染后6-18小时移除Effectene-DNA混合物，用PBS洗涤∮一次细胞，然后加入5 ml新鲜细胞培养液。 10.瞬时→转染时，进一步试验分析转染基因的表达。 转染β-gal 或 cat 报告基因的重组子常在转染后孵育24-48小时以使转染基因的表达最大化。 稳定转染时∩，在转染后24-48小时，将细胞以1:5~1:10传代至合适的』选择性培养基中。保持细胞在选择性培养☉基中直至克隆出现。注意：我们∏推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量-反应曲线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。 以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们＠ 正常的培养液（如：不⌒　含选择性抗生素的培养液），然后孵育1-2天，然后再加入选择◇性培养液。 Superfect Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤：以下步骤适用于在6孔培养板中转染贴壁细胞。如果想获得最高的转染效率，对每种细胞系的转染条件都要进行优化。1.转染前一天，用含血清和抗生素的培养基分装使每6孔培养板含2-8×105的细胞（根据细胞类型而定）。2.在细胞的正常培养条件下培养（通常37℃和5％CO2）。转染当天细胞应40-80％融合。3.转染时，用无血清培养基稀释2 ug DNA至100 ul总体积（DNA用pH 7-8的TE Buffer溶解，DNA最低浓度：0.1 ug/ul）。混合，离心几秒钟以从管顶∏去除液滴。 注意：质粒DNA的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提纯化︼的质粒适合于大多数细胞系的转染。要获得最好的重复性和最好的结果，我们推荐使用Endofree Plasmid Kit，该试剂盒可以快速有效地在质粒纯化过程中去除细菌内毒素，从而获得最◣佳的转染结果。 4.向DNA稀释液中加入10 ul Superfect Transfection Reagent，反复吸取5次或涡旋10秒钟以混合。注意：没必要一直把Superfect Reagent置于冰上。在室温中放置10-15分钟不会改变它的稳定性。5.室温下（15-25℃）孵育5-10分钟以形成转染复合物。6.孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用2ml PBS洗涤一次细胞。7.加入600 ul培养液（包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的EP管中。吹打两次以混合，立即将▂转染复合物加入6孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转染复合物分布均匀。8.将细胞与转染复合╱物在它们的正常培养条件下孵育2-3小时。9.小心移除Superfect-DNA混合物，用2 mlPBS洗涤3-4次细胞10.加入新鲜的正常培养基，孵育24-48小时。11.瞬时转染时，进一步试验分析转染基因的表达。 转染β-gal 或 cat 报告基因的重组子常在转染后孵育24-48小时以使转染基因的表达最大化。 稳定转染时，在转染后24-48小时，将细胞以1:10~1:15传代至合适的选择性培养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。 注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量-反应曲线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。 以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性抗生素的培养液），然后孵育1-2天，然后再加入选择性培养液。