人血管内皮生长因子 165(VEGF165)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中血管内皮生长因子165(VEGF165)的含量。实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中↑人血管内皮生长因子165（VEGF165)水平。用纯化的人血管内皮生长因子165抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血管内皮生长因子165，再与HRP标记的VEGF165抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复∮合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人√血管内皮生长因子165呈正相关。用◣酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人血管内皮生长因子165（VEGF165)浓度。试剂盒∮组成：试剂●盒组成 48孔配置 96孔配置 保存说明书 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存标准品：720ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保▲存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存浓々缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然∞凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集》上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离▓心』。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作〖为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收↙集上清⌒，保存过程☆中如有沉淀形成，应该再次离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行◆。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞⌒　悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出▓细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定√量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融▽化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检㊣　测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按〗相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将◢标本放于-20℃保存，但应避免反★复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第↑一△、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取ζ100μl分别加到第三〓孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各♂取50μl分别☉加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第∩十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别Ψ为480 ng/L，320ng/L ，160ng/L，80 ng/L，40 ng/L）。2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样』品及酶标试剂，其余各步操作相∴同）、待测样品孔。在酶标◥包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终↙稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔▓壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5.洗涤：小心◣揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满「洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白「孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入※显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸㊣　光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2．浓洗涤液可能会有结●晶析出，稀ζ释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3．各步加样均应使用加╲样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本●数量多，推荐使用排枪加样。4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做〓复孔。如标本中待测物质含ω　量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物请ξ避光保存。7．严格按照说明书的』操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种◆废弃物都应按传染物处理。9．本试剂不同批号组分不○得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以♀标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根※据样品的OD 值由标准曲︾线查出相应的浓度；再乘」以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程式，计算出样品▓浓度『，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。 （此卐图仅供参考）试剂◤盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2.批内与批见应分↘别小于9%和15%检测范围： 30ng/L -600 ng/L 保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月