免疫组化实验方法

　　一·材料：

　　一抗，二抗，DAB，多聚赖氨酸载玻片

　　二·免疫组化方法的具体步骤：

　　1、取材：取实验组和对照组动物组织尽可能新鲜，PBS(磷酸盐缓冲液)洗，取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块，

　　2、固定和包埋：用4%多聚甲醛(0.1MPBS,PH7.0～7.6,含0.1%DEPC)进行固定，经70%乙醇30分钟、80%乙醇30分钟、90%乙醇30分钟两次、95%乙醇30分钟两次、100%乙醇30分钟两次、二甲苯透明30分钟两次、55℃石蜡30分钟两次、用铜制模具包埋组织块;

　　3、切片：将厚度5um的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载∞玻片上，60℃过夜;

　　4、脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、90%乙醇5分钟两次、85%乙醇5分钟两次、75%乙醇5分钟两次、自来水□　冲洗、PBS洗两次;

　　5、1%甲醇双氧水,室温10分钟, 蒸馏水洗1次,0.1MPBS洗3次×5分钟;

　　6、切片上滴加抗原修复液,室温10分钟，0.1MPBS洗3次×5分钟;

　　7、切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。

　　8、切片上滴◆加第一抗体，4℃过夜，0.1MPBS洗3次×5分钟。

　　9、切片上加生物素化第二抗体(IgG)，37℃20分钟，0.1MPBS洗3次×5分钟;

　　10、切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃20分钟，0.1MPBS洗3次×5分钟;

　　11、DAB显色：使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂※A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6分钟，充分水洗;

　　12、苏¤木素复染细胞核1分钟，充分水洗、1%盐酸酒精分化、1%胺水反蓝、充分水洗、经70%乙醇5分钟、80%乙醇5分钟、90%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、100%乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片『，

　　13、显微镜观察：选择实验组和对照组的阳性和阴性组织相、进行100×或400×的显微照相。

　　14、图象分析：选择有意义的组织相，经登录、编号、采集、分析、读取数据、最后存盘。

　　附表实验所∑　用仪器

　　1、显微镜：日本奥林█巴斯 BX51T-PHD-J11

　　2、CMOS: 日本奥林巴斯

　　3、多功能真彩》色细胞图象分析管理系统：美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus

　　4、切片机：德国莱卡RM2015

　　5、离心机：北京离心机厂LDZ5-2型

　　6、电子天平：瑞士METTERAE100型

　　7、移液器：德国EPPENDORF

　　8、干燥箱：日本三洋MIR-153型

　　9、低温冰箱：日本三洋MDF-382E型

　　10、恒温水浴箱：江苏太▼仓医用仪器厂DSHZ-300型

　　11、医用微波炉：浙江临安爱迪仪器←厂YWY781B型