犬胰岛素(INS)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书? 本试剂盒仅供科研使用。? 本试剂盒用于体外定量检测▆犬血清、血浆及相关液体样本中胰岛素(INS)的含量。? 有效期：6个月? 保存条件：2-8℃实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中犬胰岛素(INS)水平。用纯化的犬胰岛素(INS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胰岛素(INS)，再与HRP标记的胰岛素(INS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加︽底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的胰岛素(INS)呈正相关。用酶标仪在¤450nm波♀长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线∏计算样品中胰岛素(INS)浓度。试『剂盒组成 试＠剂盒组成 96孔配置 保存1 说明书 1份 2 封板膜 2片（96） 3 密封袋 1个 4 酶标包被板 1×96 2-8℃保存5 标准品：27 mU/L 0.5ml×1瓶 2-8℃保存6 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 2-8℃保存7 酶标试剂 6 ml×1瓶 2-8℃保存8 样品稀释液 6 ml×1瓶 2-8℃保存9 显色剂A液 6 ml×1瓶 2-8℃保存10 显色剂B液 6 ml×1瓶 2-8℃保存11 终止液 6ml×1瓶 2-8℃保存12 浓缩洗涤液 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保▲存样本处理及要求1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集←上清，保存过程◣中如出现沉淀，应再次卐离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上〓清，保存过程中如有≡沉淀形成，应该再次离心。3. 尿液：用无菌≡管收集↓，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细◇收集上清〓，保存过●程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的〓成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清←№。检测细胞内的成份时∞，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割〇标本后，称取重量。加入一╲定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测〒，其余冷冻备用。6. 标本采集↑后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放●于-20℃保存，但应避免反复冻ξ　融.7. 不能⌒检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶▲的（HRP）活性。操作步骤1. 标准品的稀释与加卐样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一∩孔、第二孔中♀各取100μl分别加到第三孔◆和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释∑　液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔↘中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀⊙释液50μl，混匀后从∏第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分∞别为18 mU/L， 12 mU/L，6 mU/L，3 mU/L， 1.5 mU/L）。 2. 加样：分别∮设空白孔（空白对Ψ 照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操①作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度≡为5倍）。加样将样品加于酶标板孔▃底部，尽量♀不触及孔壁，轻轻晃动混〓匀。3. 温育：用封↓板膜封板后置37℃温育30分钟。4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6. 加酶：每孔Ψ加入酶标试剂50ul，空白孔除∞外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10. 终止：每孔加终止液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白⊙孔调零，450nm波长依序测量ζ　各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止【液后15分钟以╱内进行。注意事项1． 试剂盒从冷藏环境中取出应☉在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加¤温助溶，洗涤〒时不影响结果。3． 各步加样均◇应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推＠ 荐使用排枪加样。4． 请每︽次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测☆物质含量过高（样本OD值大〖于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6． 底ω物请避光保存。7． 严格按照说明书的操◆作进行，试∩验结果判定必须以酶标仪读数为准.8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9． 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐↘标， 在坐标纸上绘出标◣准曲线，根ω　据样品的OD 值由╳标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀①释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程◆式，计算出▲样品浓度，再乘以稀☆释 倍数，即为样品的实际浓度。 （此图仅供参考）试剂盒性能1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2.批内与批间应分别小于9%和15%检测范围： 0.4 mU/L -20 mU/L