【实验原理】

　　琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。带电荷的物质在电场中的定向运动称为电泳，核酸分子是两性解离分子，在pH8.0时，DNA分子带负电荷在电场中向正极移动。采用琼脂糖凝◎胶介质作为电泳支持物，长度不同的DNA分子由于受凝胶阻遏作用大小不一，迁移速度不同，从而达到有效分离DNA的目的。

　　【实验目的】

　　(1)了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理，学■会其具体的操作程序。

　　(2)对提取的DNA进行检测，掌握紫外电泳图谱的观察分析方法。

　　【仪器、材料、试剂】

　　(一)仪器

　　1.电泳装置：电泳仪、水平∩电泳槽、梳子、制胶槽

　　2.紫外观察：凝胶成像系统

　　3.高速离心机

　　(二)材料

　　1.琼脂糖

　　2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)

　　3.硼酸

　　4.乙二胺四乙酸(EDTA)

　　5.溴酚蓝

　　6.蔗糖

　　7.溴化乙锭(EB)

　　8.DNA Marker(λDNA)

　　9.称量纸、容量瓶、瓷盘、一次性手套◥、取液器、三角瓶、量筒(100mL)、Tip头(10uL)、胶带

　　(三)试剂配制[www.bbioo.com]

　　1.5×TBE(pH8.0)(电泳缓≡冲液) 1000 ml

　　配制方法：

　　称取Tris 54g、硼酸 27.5 g，再加入20ml的0.5mol/LEDTA加¤三蒸水定容至

　　1000ml摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

　　2.凝胶加样缓冲液(6×)(指示剂) 100 ml

　　称取溴酚蓝0.25 g、蔗糖40 g然后加入三蒸水定容至↓100ml摇匀后，4℃保存备用。

　　【实验步骤】

　　(一)、制胶

　　1.称取0.4g(适量)琼脂糖置于三◣角瓶中，加入50ml 0.5×TBE缓冲液。

　　2.微波炉→加热，煮沸、振摇，反复加热、振摇2-3次，使琼脂糖充分融化◥。

　　3.胶带将胶床两端粘好，底部粘严，以防凝胶渗漏，插好梳子。

　　4.待胶冷≡却至60℃左右时，将融化的琼脂糖小心地倒入胶床中，速度要快，让 胶自然冷却至完全凝固№(约需要20-30分钟)。

　　5. 小心向上方拔↘出梳子，避免前▲后左右摇晃，以防破坏胶面及加样孔，去掉制胶槽两边的胶带，小心将胶和胶床放卐入电泳槽中，样品孔〇在阴极端。

　　6. 向电泳槽中加入0.5×TBE电泳◣缓冲液，液面高于胶面约1-2mm。

　　(二)、上样电泳

　　1、取2μl上样液(溴酚蓝指示剂)于Parafilm上，加2μl水与2μl样品DNA反复吹吸，混匀。

　　2、Tip头垂直伸入液面下胶孔中，小心上样于孔中。

　　3、接通电源，打开高压开关，电泳开始以正、负极铂金丝有气泡出现为准。

　　4、根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断⌒电源后，再取出凝胶。

　　5、凝胶取出后于含EB的溶液中染色20分钟。

　　(三)、凝胶紫外观察：

　　染色后的凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察，照相，保存，记录结果。

　　【注意事项】

　　1. 琼脂糖融♀化时，档位∑　不宜太高。

　　2. 制胶和加样过程中要防治气泡╳的产生。

　　3. EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。

　　4. 加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或

　　DNA带型不整齐。

　　5. 电源接♂通时，应核实凝胶的方向是否正确。

　　6. 电泳仪有电压显示，并不一↘定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。

　　负极的气泡比正极多ぷ一倍，表示电泳已开始。

　　7. 溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化♀乙锭的DNA呈橙》红色荧光，所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位∩置。