人肺炎支原体抗原(MP Ag)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中肺炎支原体抗原(MP Ag)的含量。实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肺炎支原体抗原(MP Ag)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往◣包被单抗的微孔中依次加入肺炎支原体抗原(MP Ag)，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底♂洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样ζ　品中的肺炎支原体抗原(MP Ag)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肺炎支原体抗原(MP Ag)含量。 试剂盒组成：试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存说明书 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标』包被板 1×48 1×96 2-8℃保存标准品：135 ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保▲存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存终止液〓 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存浓缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存样本处理▂及要求：1. 血清：室︽温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收╲集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成「，应该再次离心。3. 尿液：用无菌管▆收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照㊣　实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无◥菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液㊣，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入〓一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保№持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后№一份待检测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻卐融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1. 标准品的稀释√与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀※释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中◢各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀□　释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六╳孔中各取50μl分别加到卐第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀ζ后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后Ψ 各孔加样量都为50μl，浓度分别◎为90 ng/L，60 ng/L ，30 ng/L，15 ng/L，7.5 ng/L）。2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将⊙样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后Ψ置37℃温育30分钟。4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5. 洗涤：小心揭掉▲封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤∞液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加↙入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震●荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测∑量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止【液后15分钟以内进行。注意事项：1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方「可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条〒应装入密封袋中保存。2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水○浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3． 各步㊣　加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控ξ　制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做〖复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先ω用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最◣后乘以总稀释倍数（×n×5）。5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉◆污染。6． 底¤物请避光保存。7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应∞按传染物处理。9． 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以标╳准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根☆据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的◆浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入Ψ 方程式，计算出样品①浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。 （此图仅※供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数▃R值为0.990以上。2.批内与批见应分别小于9%和11%检测范围： 5 ng/L -100 ng/L 保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月