今儿个就是雨天，新的一周不过刚刚开始，马上让人觉得又过︾了一半，时间如此之快，朋友们，不抓紧时间╲学习可不行呀。月初雨又来：让上海恒远陪您通过免疫共沉淀来确定结合蛋白。
免疫共沉淀的优、缺点
优点：1、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响◤。
2、可以分离得到天然状态的相互作用蛋★白复合物。
3、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。
缺点：1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
2、必※须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测■的抗体，所以，若预测◥不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性;
3、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用。
下面是恒远生物为朋ㄨ友们整理出的通过免疫共沉淀确定结合蛋白步骤■方法：
1、用磷酸盐缓冲≡液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中;
2、将每毫升细胞悬液转移〗到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大♂速度离心15 ;
3、收集上清(约30 ml)并加入30 μg的适当抗体ㄨ，4℃摇动免疫⌒ 沉淀物1 h;
4、加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min;
5、用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次;
6、吸出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠◎中，煮沸4 min;
7、将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下】电泳过夜;
8、通过考马斯⊙亮蓝染色观察蛋白质泳带;
9、从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1 ml 50%乙腈▽洗两次，每次3 min;
10、用胰蛋白◎酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱;
11、通过窄孔高效液相色谱分离＠肽。将收集⊙的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
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