人（Human）细胞外基质蛋白1（ECM-1）ELISA 检测试剂盒　　　　　　　　　　　　本试剂仅供研究使用 标本：血清或血浆　试验原理：　　　ECM-1试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知ECM-1浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将ECM-1和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中ECM-1的浓度呈比例关系。试剂盒内容及其配制：　试剂盒成〓份 96孔配置 48孔配置96/48人份酶标板 1块板（96T） 半块（48T）塑料膜板盖 1块 半块标准品：80ng/ml 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml）空白对照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml）标准品稀释缓冲液 1瓶（8.0ml） 1瓶（4.0ml）生物素标记的抗ECM-1抗体 1瓶（8.0ml） 1瓶（4.0ml）亲和链酶素-HRP 1瓶（12ml） 1瓶（6.0ml）洗涤缓冲液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml）底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）终止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）自备材料：蒸馏水。加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。振荡器及磁力搅拌器等。样品收集、处理及〓保存方法：血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去▲除颗粒。细胞上清液---1000×g离心10分钟除颗粒和聚合物。组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分▼-70 ℃保存，避免反复冷冻▂。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检↑测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。操作注意事项：试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准【品应丢弃，不可保存。实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终「止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒卐里的各种成份及样品。底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。安全性：避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。实验︼中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。试剂的准备：标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：　80 ng/ml （6号标准品） 原倍浓度不用稀∞释直接加入50ul。　40 　ng/ml （5号标准品） 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释√液　20 ng/ml （4号标准品） 100ul的5号标准品加▃入100ul的标准品稀释液　10 ng/ml （3号标准品） 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液　5.0　ng/ml （2号标准品） 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液　2.5 ng/ml （1号标准品） 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液0 ng/ml （空白对照） 原始浓度不用稀释直接加入50ul。洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。试剂盒性能：1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。2. 特异性：不与其它细胞因子反应。3. 重复性：板内、板间变异系∞数均小于10%。 操作步骤：使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自▲己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。甩去Ψ孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。在450nm波长处测定各孔的OD值。结 果 判 断 与 分 析：1、仪器值：于波长450nm的酶标仪◣上读取各孔的OD值2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的ECM-1标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的ECM-1含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度, 再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出ζ样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。3、检测值范围：0-80ng/ml4、敏感度： 0.1 ng/ml