目的及要求
1.了解质粒作为载体在基因工程中的应用。
2.熟记提取质粒的基本原理，学习提取过程和方法。
[实验原理]
基因工程诞生于1973年。在这一年。斯坦福大学的S。Cohen等人将大肠杆菌的抗四环素质粒PSC101和抗新霉素及磺胺的质粒R6-3在体外用EcoRI进行切割，并把他们连接在一起形成一新的重组质粒：然后，将此重组质粒转化到大肠杆菌中。结果，在含有四环素和新霉素和新霉素的平皿中，筛选出了抗四环素和新霉素的重组菌落。这是第一次实现重组体转化成功的例子，基因工●程从此诞生。目前，基因工程已成为分子生物学的一个重要领域，但对其还没有一个统一的公认定义。一般认为基因工程是指：在体外，将核酸分之(无论采取什么方法从细胞中取得)组合到任何ω病毒、细菌质粒或其它载体系统(分子)中，形成遗传物质的新组合，并使之进入原来没有这类分子的宿主体内，而能持续稳定地繁殖。基因工程的最大特点使以重组DNA技术开辟了在短时间内改造生物遗传性状的新天地。
基因工程的研究内容如下：
1. 目的基因的获取 。
2. 克隆载体的选择与改建。
3. 目的基因与载体的连接。
4. 重组DNA导入受体细胞。
5. 重组☉体的筛选。
6. 设法使目的基因实现功能蛋白的表达。
基因工程的重要环节就是如何把外源基因导入到受体细胞中去。外源基因自己很难进入受体细胞中，既是进入受体细胞中，一般也不能进入复Ψ制和表达。这是因为我们得到的目的基因不带有复制子系统和表达调空系统，所以我们必↑须利用运载工具即载体将外源基因导入到受体细胞中去。
质粒就是一种最常用的载体。他是染色体以外的能自主复制的双莲、闭合、环状DNA分子。广泛存在于细胞中，在一些动、植物细胞中也发现有质粒存在。作为载体的质粒必须具备以下六〖个特点：(1)能自主复制：(2)具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能：(3)具有1-2个筛选标记：(4)分子量小，多拷贝，易于操作：(5)是非结合性质粒即不含有结合转移基因，在自然条件下不能从一个细胞转移到另一个细∑ 胞中去：(6)转化效率高。
本次实验是从大肠杆菌中提取和纯化质粒，以备进一步研究之用，其原来如下：
从大肠杆菌中提取和纯化质粒的方法很多，但不外乎三个主要步骤即细菌的培养、细菌的收集☆和裂解、质粒的分离和纯化。
1. 细菌的培养
挑单个菌落接种到适▼当培养基中培养。通常以细菌培养夜的O。D600nm值来判断细菌的生长状况，一般情况下ζ，O。D600nm=0。4时，细菌处于对数生长期：O。D600nm=0。6时细菌处于对数生长后期。由于质粒〖在细菌内进行复制时，往往受到宿主的控制，因此在对数生长后期可进入氯霉素。氯霉素可抑制细菌的蛋白质生物合成和染色体DNA的复制，而质粒的复制不受其影响而得以大量扩增。对于新一代的质粒如pUC质粒系列，由于宿主对其复制控制不严，所以添加氯霉素已不十分必要。使用氯霉素的目的是，在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和数量以降低细菌裂解物的复杂性和粘稠度。
2. 细菌的收集和裂解
细菌在生长过程中，会将大量代谢物排到培养液中。为提高质粒的纯度，往往通过离心弃除培养液，在将细菌沉淀适当干燥或用缓冲液漂洗1~2次，以便尽量将培养液去除干净。
裂解细菌的方法很多，如SDS法、裂解法、煮沸法等。它们各有利弊，应根据所提【质粒的性质、宿主菌的特性及纯化质粒的方法等因素加以选择。
本实验采用碱裂解法。首先破坏细菌的细胞壁：再用SDS使细胞膜崩解，与此同时用NaOH提高溶液的pH值，使染色体DNA、蛋白质及质粒均变性。
3. 质粒的分离和纯化
往第二步溶液中加入酸性溶液使裂解液的pH值恢复到中性，此时，质粒可复性并恢复原型，而染色体DNA仍处于变性状态。经离心，染色体DNA与细胞碎片一起沉淀。然后，再用酚、氯仿等蛋白质变性剂去除蛋白质，用Rnase去除RNA，即可■得到质粒的粗制品。以后，可用超离心法、电泳法、离子交换层析法或排组层析法等进一步纯化质粒。
[仪器与消耗]
1.仪器：电热手提高压锅、恒温空气震荡器、台式高速离心机、旋涡混匀器、颗粒型制冰机、冰箱、可调式移液器。
2.耗材：含有重组质粒(pUC18/GAPDH)的菌株(HB101)Eppendorf吸管
[步骤]
1.酶切：20μl酶切体系(按下表〓加试剂)
质粒DNA 10╳酶缓冲液 EcoRI(15u/μL) BamHI(15u/μl) 双蒸水
实验组1 6μL 2μL 1μL 1μL 10μL
实验组2 6μL 2μL 1μL 11μL
对照组 6μL 2μL — -- 12μL
混匀，37℃水浴1-2小时。
2.向上述个反应管中，分别加入4μL 6×上样缓冲液。
3.电泳：
①将1%浓度的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)铺于水平电泳槽上，并插上梳子。
②待凝胶凝固，将梳子拔出。往电泳槽中注入0.5×TEB缓冲液，直至刚没过凝胶。
③按以【下顺序上样：
1道 2道 3道 4道
DNA分子量标准(Marker) 对照组样品(未酶切质粒) 实验组1样品 实验组2样品
④将加样一端接上负极，另一端接上正极，电场强度5V/cm，待溴酚蓝移动到接近正极一端停止电泳。
⑤将凝胶移至黑暗处，用紫外灯观察电泳结果。
[试剂]
1. EcoRI(15u/μL)
2. BamH I(15u/μL)
3. 5×TBE(pH8.3电泳缓冲液)Tris 5.4g
硼酸 2.25g
EDTA 0.46g
ddH2O2定容至 100ml
4. 1%琼脂糖：琼脂糖1g，0.5×TBE100ml。
5. 6×上样缓冲液：50%甘油，1×TBE，0.5%溴酚蓝 ,0.5%二甲苯青
6. 溴化乙锭(EB)：0.5mg/ml
质粒DNA
