线粒体DNA(mtDNA)是进行分子进化研究和母性遗传研究☆的重要材料,但传★统的两步式mtDNA提取方法是先温和裂解细胞,分离线粒体,然后再从线粒体中提取mtDNA。此方法中的温和裂解细胞的条件十分难以控制,需要针对不同组织材料单独进行优化。本方法克『服了上述缺点,具有下列优点:
1. 不需要单独纯化线粒体,柱∩式法纯化,操作简单快捷。
2. 得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3. 每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每◥克组织一般能得到3-5 ug mtDNA。
4. 注意:本产品只适合于动物材料,不适合于植物材料,因为植物线ω 粒体DNA一般都十分巨大,非常难提。
成 份 50次包装
溶液A13 mL
溶液B13 mL
溶液C18 mL
离心吸附柱50 套
通用洗柱液50 mL
DNA洗脱液10 mL
使用手册1份
常温运输,短期可以在室温放置;长@期保存最好放4℃。
无
一:培养细胞预处理
1. 用自备的0.25%胰酶消化液处理约107个培※养细胞,离心收集后弃上清。
2. 用PBS或TBS等缓冲液洗涤细胞两次,离心得到的细胞沉淀○直接用于mtDNA提取。
二:组织细胞预处理◥
3. 用剪刀将1g新鲜的动物组织剪碎(芝麻大小最好),转移到1.5mL塑料离心ㄨ管中,用于mtDNA提取。注意:最好不要使用冻存的动物组织,因为冻凝过程中形成的冰晶会将线粒体刺破,使其DNA释放出来【被胞浆中的DNA酶降解,影响回收率。
三:血液预处理
4. 将3-5 mL抗凝外周血静置↓30分钟或低速离心5分钟,取白♀细胞层。
5. 用自备PBS洗涤白细胞两次,得到的白细胞沉淀用于mtDNA提取。
四:mtDNA提取
5. 在细胞沉淀或剪碎的组织中加」入250 uL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如◤果是剪碎的组织,不要等成块的组织溶解即可继续下步操作。
6. 加入250 uL常温≡的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用①),温和反复颠倒混匀10次。千万不要剧烈振荡。
7. 冰上放置6-8分钟。注意不要超过8分钟。
8. 加入350 uL冰浴的溶液C,温和混匀4-6次,可见白色沉淀物产▆生,然后放冰上放置20-25分钟。
9. 室温12000-15000 g离心10分钟,小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大,有时候出现沉淀漂浮是正常现〗象,取上清时避开漂浮的沉淀即可。
10. 静置5分钟以让DNA与离心吸附柱充分结合,此步十分△重要。
11. 室温12000-15000 g离心1分钟,弃收集管中的废液。
12. 加入500 uL的通用洗柱液,室温12000-15000 g离心1分钟,弃收集管中ㄨ废液。注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要将盖拧紧存放,否则乙醇会挥发。
13. 重复上步1次。
14. 室温12000-15000 g离心1分钟,甩干残留液体。此步不能@ 省略,否则残留乙醇会影响DNA的后续使用(如DNA上样时不能沉淀□ 到加样孔中)。
15. 将离心吸附柱置于一个新的1.5 mL塑料离心管中,加入30-50 uL 65-80℃预热的DNA洗脱液,室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液也可以用于洗脱,但产量稍微有所降低。
16. 室温12000-15000 g离心1分钟,离心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司离心吸附柱结合DNA能力较强,如果再加30-50 uL DNA洗脱液◆到离心吸附柱中,往往还能洗脱▽下很多mtDNA(相当于第一次洗脱的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液来洗脱。
18. 12000-15000 g离心1分钟,离心管底溶液♂即线粒体DNA。每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克组织一般能得到3-5 ug mtDNA。如果DNA需要浓缩,可以使用︻本公司的核酸浓缩剂。
19. 由于DNA机械断裂,电泳时DNA可能不呈现专一的带,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。
线粒体
线粒体是合¤成ATP和脂肪酸的细胞器,每个细胞有多个线『粒体,每个线粒体有多个线粒体基因组,例如每个酿酒酵〇母(S.cerevisiae)细胞里有20多个线粒体,人淋巴细胞有数个,肝细胞有500-2500个,卵母细胞有上千卐个。除少数低▲等真核生物线粒体基因组为线状DNA外,其他生物的线粒体基因组都是环状DNA。线粒体基因组①缺乏组蛋白,故无核小々体。哺乳〓动物的线粒体基因DNA没有内含子,几乎每一对核苷酸都参与一个基因的组成,有许多基因的序列是重▂叠的。不同物种的线粒体基因组的大小相差悬殊,在动物中的趋势是物种越高等,mtDNA越小。常见物种mtDNA的大小◥列表:
物种mtDNA大小(KB)例子
脊椎动物15.7-17.5小鼠为16,295bp;
人类为16,569bp
昆虫14.5-17.9
原虫18.5-40.0
真菌18.9-95.0酵母为75Kb,曲霉为32Kb
藻类15.0-18.0
高等植物120-2700玉米mtDNA为600 Kb
人mtDNA只有D环区(D-loop,参与复制启动)和另外87个bp不是编码基因外,其余♀序列共编码13个蛋白质(细胞色素b、细胞色素▲氧化酶的3个亚基、ATP酶的2个亚〓基以及NADH脱氢酶的7个亚基)、24个rRNA(包括1个16SrRNA、1个12SrRNA和22个tRNA)。人类的神经肌肉变性疾病如Leber氏遗传性▼视神经病、帕金森病、早老痴呆々症、线粒体脑肌病、母系遗传的糖尿病和耳聋等都同线粒体基≡因有关。与细胞核DNA相比,mtDNA具有下列特←点:①突变率高,是核DNA的10-100倍左右,有利于检查出在较短时期内基因发生的变化,有利于比较不同物种的相同基因之间的差别,确定这些物种在◥进化上的亲缘关系;②母性遗传(maternal inheritance),这是由于动物精子的细胞质极少,子代mtDNA基本上都是来自卵细胞,因此←具有相同mtDNA序列的个体必定是来自一位共同的雌性祖先。