液相色谱法测定狼疮灵颗※粒中的芍药苷

　　摘要：芍药苷为吸湿性无定形棕褐色粉末(90%为类白色粉末)， [α]16D-12.8。(C=4.6，甲醇)，四醋酸酯为无色针状结晶，熔点：196℃。在酸性环境下芍药甙稳定(pH2～6)，在碱性环境下不稳定。

　　目的建立狼疮灵颗粒中芍药苷的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱：HypersilODS-2(150mm×4.6mm,5.0μm);流动相：乙腈-0.4%的磷酸水溶液(10∶90);检测波长：230nm;流速：1.0mL/min,柱温：25℃。结果芍药□苷在0.608～3.04μg范围内呈良好的线性关系(r=0.9999),加样回收率97.77%,RSD=0.62%(n=5)。结论该方法快速可行、简捷准确、重复性好、结果可靠,可用于控制狼疮灵颗粒的质量。

　　狼疮灵颗粒主要是由赤芍、牡丹皮、生地黄、忍冬藤等中药组成的医院复方制剂,具有凉血散瘀、清热解毒之功效。方中芍药苷为主要有效成分,具有浓度和机能依赖性的双向免疫调节作用,临床主要用于治疗系统性红斑狼疮。本研究采用高效液相色谱(HPLC)法对狼疮灵颗粒中芍药苷进行含量测定,建立芍药苷含量的HPLC测定方法[1-2]。

　　1仪器与试药

　　Agilent1100型高效液相色谱仪,MettlerToledoAG135型电子分析天平(瑞士Mettler公司),SCQ-250型超声波提取仪(上海申波超声公司)。芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号110736-200732);狼疮灵颗粒(成都中医药大学附属医院提供,批号100315、100318、100322、100329,规格为15g/袋)。乙腈为色谱纯,水为纯净水,其他试剂均为分析纯。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件

　　色谱柱：HypersilODS-2(4.6mm×150mm,5.0μm,依¤利特公司);流动相：乙腈-0.4%的磷酸水溶液(10∶90);检测波长：230nm;流速1.0mL/min;柱温：25℃;进样量：10μL。

　　2.2溶液制备

　　2.2.1对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品3.04mg,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得对照品卐溶液(1mL含芍药苷0.304mg)。

　　2.2.2供试品溶液的制备取本品0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50mL,摇匀,称定重量,超声处理(功率300W,频率40kHz)20min,放冷至室温[3],再称定重量,用甲醇补足减失的重量♀,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

　　2.2.3阴性对照品Ψ 溶液的制备按狼疮灵颗粒制备工艺制得缺少赤芍的阴性样品制剂,再按“2.2.2”项下方法制得阴性对照品溶液。

　　2.3线性关系考察

　　取上述对照品溶液,分别自动进样2、4、6、8、10μL。以芍药苷峰面积积分值为纵坐标,以芍药苷对照品的进样量(μg)为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程为：Y=1427.68X+5.96,r=0.9999。结果表明,进样量在0.608～3.04μg范围内⊙线性关系良好。

　　2.4专属性试验

　　精密吸取对照品溶〖液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL,按上述色谱条件测定。

　　2.5精密度试验

　　精密吸取对照品溶液10μL,重复进样5次,测得峰面积积分值,计算,得芍药苷的RSD=1.19%(n=5),表明精密度良好。

　　2.6稳定性试验

　　精密吸取同一批号的供试品溶液(批号100318),按色谱条件分别于制备后0、4、8、12、16、24h进行测定。记录峰面积,计算得芍药苷的RSD=1.30%(n=5),表明芍药苷含量在24h内稳定性【好。

　　2.7重复性试验

　　精密称取同一批号(批号100318)的样品5份,按供试品溶液制备方法制备,并按上述色谱条件测定,测得芍药苷平均含量9.73mg/g,RSD=1.24%(n=5)。

　　2.8加样回收率试验

　　精密称取已知含量的狼疮灵颗粒0.10g,精密添加一定量的芍药苷对照品,按供试品溶液制备方法制备,并按上述色谱条件测定。结果平均回收率为97.77%,RSD=0.62%。见表1。

　　2.9样品测定

　　分别精密称取不同批号的狼疮灵颗粒约0.5g,按供试品溶液制备方法制备,按以︽上色谱条件测试。结果见表2。根据试验结果,考虑到药材的来源,以及〖制剂生产、储藏等因素,暂拟定每批样品以芍药苷含量为标准,每1g颗粒不得∩低于9.7mg。

　　表1加样回收率试验结果

　　样品重

　　量(g)样品中含

　　量(mg)加入量

　　(mg)测得量

　　(mg)回收率

　　(%)平均回收

　　率(%)RSD

　　(%)

　　0.10190.9911.0011.96797.43

　　0.10240.9960.9751.95598.35

　　0.10170.9890.9871.94696.9297.770.62

　　0.10150.9870.9901.96198.29

　　0.10230.9950.9841.95897.84

　　表2样品中芍药苷含量测定结果(mg/g)

　　批号芍药苷含量平均含量

　　123

　　1003159.789.719.739.74

　　1003229.749.709.719.72

　　1003299.729.789.789.76

　　3讨论

　　本试验※考察了水浴回流提取、超声提取、索氏提取3种方法,结果超声提取法优于回流法和索氏提取法;考察了甲醇、70%乙醇和50%乙醇等3种提取溶媒对芍药苷提取效果的影响,结果甲醇提取效果明显优于70%乙醇和50%乙醇;考察了提取时间对芍药苷提取效果的影响,结果以★甲醇为提取溶媒,超声提取20min效果较优。

　　本试验曾采▆用2005年版《中华人民共和国药典》(一部)赤芍中芍药苷测定所用流动相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(40∶65),结果主峰分离度不好,存在干扰,经过分析比较,确定了乙腈-0.4%磷酸水溶液(10∶90)为流动相,杂峰集中,可使芍药苷得到较好的分离。

　　本法〓提取方法简单,分析快速,精密度高,重复性好,阴性无①干扰,可较好控制本品的质量。