先在试管中加入含有抗体的琼脂，凝固后在中间加一层普通琼脂，冷却后再将抗原溶液加到上层，放置后，下层的抗体和上层的抗原向中间琼脂层内自由扩散，在抗原抗体浓度比例恰当处形成沉淀线。此方法做起来麻烦，并且只能测定一个标本，所以临床检验中很少用。
(二)平板法
该方法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。该方法的基本步骤是：先在乎板玻璃上倾注一均匀的琼脂薄层，凝固后在琼脂板上打孔，孔径一般为3mm，孔间距通常在3～5mm，孑L的排列可呈梅花形、双排形或∏三角形等。在相＠对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37~C 18—24h后，琼脂中各自扩散的抗原和相对应的抗体可在浓度比例适当处形成可见的沉淀线。根据沉淀线的有无、形态和位置可作如下分析：
1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计。沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线如果靠近抗原孔，则表示抗体含量较大;沉淀线如◣果靠近抗体孔，则表示抗原含量较大;不出现沉淀线则表明无对应的抗体或抗原或者抗原过量。
沉淀线形状、位置与抗原抗体分子量及浓度的关系
2.抗原或抗体相对分子量的分析。抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量的影响。分子量小者扩散快，反之则较慢。由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方;如果两者分子量大致相等，则形成直线。
3.抗原性质的分析。两种受检抗原的性质可完全相同、部分相同或完全不同。三种情况在双向扩散试验中表现如图所示，A两条沉淀线互相卐吻合相连，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，两个抗原相同，C沉淀线呈部分相切，说明两个抗原之间有部分相同;B两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不№同。
双向扩散试验不同形态的沉淀线
4.抗体效价的滴定。双向扩散试验是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度，稀释抗体;或者抗原和抗体双方皆作不同的稀释，经过⌒自由扩散，形成沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。
5.抗原或抗体纯度鉴定。用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条沉淀线♀说明不纯。
双向扩散试验简单易行，用途广泛，但该∑ 技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量，这些弱点在相当程度上限制了它的应用。
