被分离组分在柱中的洗脱原理

　　Ⅱ 基本概念和理论

　　一、基〓本概念和术语

　　1.色谱图和峰参〖数

　　⊕色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile).

　　⊕基线(base line)--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

　　⊕噪音(noise)――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱⌒　被污染所致。

　　⊕漂移(drift)基线随时间√的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

　　⊕色谱峰(peak)--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线☆上的突起部分。正常●色谱峰近似于对称性正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和脱尾峰(tailing peak ).前者少见。

　　⊕拖尾因子(tailing factor,T)--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称︾因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。

　　⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。

　　⊕峰高(Peak height,h)――峰的最高点至峰底的距离。

　　⊕峰宽(peak width,W)--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。

　　⊕半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)--峰高一半处的峰宽。W h/2=2.355σ。

　　⊕标准偏差(standard deviation, σ)--正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰〗宽之半。正常ξ峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之，σ大，峰形胖、柱效低。

　　⊕峰面积(peak area,A)――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064Wh/2h

　　2.定性参数(保留值)

　　⊕死时间(dead time,t0)--不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通Ψ 过色谱柱的时间♂。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测♀定死时间。

　　⊕死体积(dead volume,V0)――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相◤所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据，Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平▓衡过程，其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展⊙，这3部分体积应尽◥量减小。V0=F×t0(F为流速)

　　⊕保留时间(retention time,tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

　　⊕保留体积(retention volume,VR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=F*tR .

　　⊕调整保留时间(adjusted retention time,tR’)--扣除死时间后的〖保留时间。也称折↘合保留时间(reduced retention time)。在实验条件(温度、固定相等)一定时，tR’只决定于组分的性质，因此，tR’(或tR)可用于定性「①。TR’=tR-t0

　　⊕调整保留体积(adjusted retention volume,VR’)--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’

　　3.柱效参数

　　⊕理论塔板数(theoretical plate number,N)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。

　　N取决于」固定相的种类㊣、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的【性质。如果峰形》对称并符合正态分布，N可近似表示为：

　　N=(tR/σ)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2

　　W：峰宽 ; σ：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。

　　N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱○的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高■则逐渐降低←。

　　用半峰宽计算〖理论塔板数︻比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰↓宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。

　　N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱↑长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)

　　若用调〒整保留时间(tR’)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板╱数(N有效或Neff)=16(tR’/W)2

　　⊕理论塔板高度(theortical plate height,H)每单位柱长的方差。H=。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H=L/N

　　4.相平衡参数(distribution coefficient,K)--在一定温度下，化合物在两相间达□　到分配平衡时，在固定相与流动相♂中的浓度之比。K=[xs]/[xm]

　　Cs-溶质在固定相中的浓度

　　Cm-溶剂在流动相中的浓⌒　度

　　分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法◣为吸附系数，离子交☆换色谱法为选择性系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为滲透参■数。但一般情』况可用分配系数来表示。

　　在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(Cs 、Cm很小)时，K只取决于组々分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱①峰为正常峰;在许〓多情况下，随着浓度的增大，K减少，这时色谱峰为拖尾峰;而有时随着溶质ㄨ浓度的增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能较少进样量，使组份在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。

　　在同一色谱条件↘下，样品中K值大的组份在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱;K值小的♂组份则滞留时间短，先流出色谱∏柱。混合物中各组份的分配系数相差越大，越容易分离，因此，混合物中各组份的分配系数不同是色谱分离的前提。

　　在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践※中主要靠调整流动相的组成配比及PH值，以获得组分间的分配系数差㊣　异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

　　⊕容量因子(capacity factor,K)--化合物ぷ在两相间达到平衡时，在固定相与流动相中的量之比。K=(tR-t0)/t0=tR’/t0(或溶质在固定相中的量/溶质在流动相中的量)。因此，容量因子也称质量分配系数。

　　{K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=(tR-t0)/t0=K*Vs/Vm Vs：色谱柱中固定●相的体积; Vm：色谱柱中流动相的体积。｝

　　分配系数、容量〓因子与保留时间之间有如下关系：k===K=,tR’=kt0。上式说明容量因子的物↘理意义：表示一个组份在固╲定相中停留的时间(tR’)是不保留组分保留时间(t0)的几倍。k=0时，化合物全部存在与流动相中，在固定相中不保留，tR’=0;k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。

　　容量因子与分配系数的不ζ　同点是：K取决于组分、流动相、固定〓相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关;k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于tR’、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应【用更广泛。

　　⊕选择性因子(selectivity factor,α)--相邻两组份的分配系数或容量因子之比。α==(设k2>k1)。因k=tR’/t0,则α=k2/k1，所以α又称为相对保留时间(《美国药典》)。

　　要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化◥合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填ξ　充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学←性质的差异，即分卐子间相互作用力的差异。

　　5.分离参数

　　⊕分离度(resolution,R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R=(tR2-tR1)/[(W1